研究背景Gold等在1994年首先报道免疫抑制剂FK506能提高大鼠坐骨神经挤压伤后轴突再生速率，促进神经形态和功能恢复，并在预变性大鼠胫神经自体脊髓植入的研究中发现FK506不仅能促进脊髓轴突的延长，而且促进了红核脊髓束的再生。这引起了国外众多学者的兴趣和关注，进行了相当深入的实验研究，包括动物体内试验和体外的细胞培养，涉及中枢神经和周围神经等多个方面，结果都提示：FK506有强大的促神经生长作用。那么，FK506促进神经再生的机制究竟是什么?目前还没有定论，认为存在两种可能：第一，FK506-FKBP12（immunophilin，免疫亲合素）复合物对免疫反应的抑制促进了神经的生长或再生；第二，神经营养作用。另外还有联合机制的假说，即免疫抑制作用和神经营养作用共同参与促进了周围神经再生的过程。有作者猜测FK506通过干预细胞凋亡机制促进神经的再生和功能恢复。这仍然是一个有待于深入研究的课题。研究表明，核因子-κB（NF-κB）与神经损伤密切相关。鼠脑损伤后可致NF-κB的长时间激活，创伤后1～2小时内，激活的NF-κB主要存在于轴突，在创伤24小时后激活的NF-κB主要存在于受伤皮质内的小神经细胞和星形胶质细胞内，这种激活可在脑皮质中至少持续1年。同时，激活的NF-κB在创伤1小时后出现于脑血管内皮细胞内，持续时间也在1年以上，神经胶质细胞内NF-κB的长期激活可引起该部位的脑萎缩。脊髓创伤亦可致NF-κB的激活，脊髓创伤可引起自由脂肪酸特别是花生四烯酸（AA）的释放，激活NF-κB，降低其抑制蛋白（IκB）的水平，诱导氧化应激反应，引起脊髓神经元的损害。创伤后NF-κB的激活能引起机体强烈的炎症反应，NF-κB可促使TNF-α、IL-12、巨噬细胞炎性蛋白（MIP-1a）、一氧化氮（NO）等炎性介质的产生增加，可使抗炎性介质IL-10的产生减少，而TNF-α又可激活NF-κB，进一步扩大炎症反应。在鼠星形胶质细胞中，炎性介质缓激肽可通过活化NF-κB致使IL-6的大量产生和分泌，最终可致血脑屏障的破坏，但此过程可被Ca²⁺／钙调蛋白依赖的蛋白激酶（KN-93）所抑制，NF-κB抑制蛋白（IκB）的过度表达亦可抑制缓激肽诱导的IL-6的分泌。在人类星形胶质细胞，IL-1是炎症相关基因的有效诱导物，IL-1比TNF更能有效地激活核转录因子活化蛋白1（AP-1）和NF-κB。近年来的研究认为，NF-κB可以通过调控多种凋亡相关基因的表达引起神经细胞的损伤。脑缺血后NF-κB可以介导Bcl-xs的大量表达，NF-κB还能诱导P53、C-myc基因的表达，这些基因最终在细胞凋亡中发挥重要作用，是神经细胞死亡的途径之一。在受伤后的脑组织细胞内，可以见到NF-κB的持续活化，表明NF-κB活化产生炎性反应与脑外伤后产生的脑组织进行性萎缩关系密切。细胞因子IL-1和TNF-α等均可以活化NF-κB，启动NF-κB调节的基因程序，使炎性反应呈持续性变化。可见，NF-κB通过调控炎症和细胞凋亡在神经损伤中起重要作用。FK506免疫抑制作用机制正是通过与T细胞胞质的FK506结合蛋白FKBP（FK506 Binding Protein）结合形成FK506／FKBP复合物，再与T细胞胞浆内的Ca²⁺-钙调蛋白依赖性蛋白磷酯酶活性蛋白（calcineurin）结合，竞争性抑制calcineurin与其底物T细胞核因子（NF-AT、NF-κB）结合，从而抑制其去磷酸化，使之不能激活IL-2、γ-干扰素的转录因子，抑制了细胞因子的产生和T细胞的活化。与此相反，在成纤维细胞、肾小球膜细胞，FK506可激活转录因子NF-κB，并且在体内和体外均诱导NF-κB调节的IL-6和IL-8等重要的炎症因子。那么在神经系统中，FK506与NF-κB的关系又是如何?FK506是否正是通过抑制NF-κB的活性和表达，抑制炎症反应和神经细胞凋亡，从而发挥了促进损伤神经修复的作用?神经干细胞的发现打破了神经元不会再生的传统观念，目前已经从胚胎和成年哺乳动物的中枢神经系统分离、纯化出神经干细胞。神经干细胞不仅能促进神经元的再生和脑组织的修复，而且通过基因修饰还可用于神经系统疾病的基因治疗，表达外源性的神经递质、神经营养因子及代谢性酶，为许多难以治疗的神经系统疾病提供了新的治疗途径。研究发现，某些细胞因子可以在一定程度上诱导神经干细胞的分化，但目前尚没有哪一种细胞因子能在体外将神经干细胞全部诱导分化为所需的功能（目的）神经细胞；Li等曾报道维甲酸（Retinoic acid，RA）和神经生长因子（Nerve growth factor,NGF）是定向诱导胚胎干细胞（Embryonic stem cell,ESC）分化为神经细胞的常用细胞因子。RA虽然在诱导ESC向神经干细胞分化中具有十分重要作用，但是在诱导ESM向神经干细胞分化时并非都分化成为所需的功能（目的）神经细胞，据报道仅有10％～30％分化为神经元，而大部分则分化为星形胶质细胞，少突胶质细胞；同时在应用RA诱导ESC分化为神经干细胞时尚需要其它细胞因子参与，除前述的RA外，还有白细胞介素类（包括IL-1、IL-7、IL-9、IL-11等），生长因子类如神经生长因子（NGF）、碱性成纤维细胞生长因子（bNGF）、上皮生长因子（EGF）、胶质细胞源性神经营养因子（GDNF）等。不同种类的细胞因子、同一细胞因子不同浓度，以及多种细胞因子联合应用对神经干细胞诱导分化作用各不相同。在神经干细胞发育分化的不同阶段，相同细胞因子的作用亦不同。多项研究显示，神经干细胞具有很强的分化为功能神经细胞的潜力，通过在神经干细胞分化发育不同阶段筛选定向诱导分化作用最佳的细胞因子，或探索细胞因子组合最佳方案，可以在一定程度上提高神经干细胞定向分化比例。那么，FK506的神经再生促进作用，是否可能通过作用于神经干细胞，影响其增殖、分化，从而最终促进神经的修复、再生和功能恢复?本研究的第三部分试图对此进行初步的探索。目的第一部分：通过建立免疫抑制下周围神经再生研究动物实验模型，短期应用免疫抑制剂FK506后，从肌肉神经再支配和肢体功能恢复两个方面，评价神经再生和功能恢复。以期明确免疫抑制剂对周围神经修复和再生的作用，探讨短期全身免疫抑制对周围神经损伤治疗的临床意义。第二部分：在大鼠坐骨神经损伤模型，应用免疫抑制剂FK506作为影响因素，检测坐骨神经损伤后局部和相应脊髓节段NF-κB活性和炎性因子IL-6表达的变化，探讨周围神经系统FK506和NF-κB、IL-6的相关性，为阐明FK506促进周围神经再生的潜在机制提供实验依据。第三部分：观察FK506对神经干细胞增殖和分化的影响，以及是否有浓度相关性。方法第一部分1．建立免疫抑制下大鼠坐骨神经横断伤实验模型，实验组予FK506（1mg／kg／d）进行全身免疫抑制，对照组未行免疫处理。2．定期对比两组动物的比目鱼肌湿重和小腿三头肌肌力恢复率。3．对比两组相同生存期动物坐骨功能指数（Sciatic functional index，SFI）。4．对比两组动物皮层体感诱发电位潜伏期（somatosensory evoked potential，SSEP）。5．观察期内两组动物的生存率比较。第二部分1、雄性SD大白鼠40只，体重250～300g，随机分成三组：A组（N=10）：无手术对照组B组（N=10）：手术对照组：坐骨神经切断缝合C组（N=20）：坐骨神经切断缝合+FK506组C1（N=10）腹腔内注射FK506（0.5mg／kg／d）C2（N=10）腹腔内注射FK506（1mg／kg／d）2、1周后取材坐骨神经和脊髓节段(L_4-6)。3、检测指标1)逆转录（RT）-PCR检测神经和脊髓NF-κB和IL-6基因表达2) Western blot检测神经和脊髓NF-κB和IL-6蛋白表达4、统计学分析第三部分取新生SD大鼠脑组织，分离神经干细胞，体外进行培养、传代、鉴定后，分别加入20％胎牛血清和不同浓度FK506，观察细胞增殖及分化状态的变化。结果第一部分1、两组动物的比目鱼肌湿重和小腿三头肌肌力恢复率对比，实验组优于对照组。2、两组相同生存期动物行坐骨功能指数（Sciatic functional index，SFI）测定，实验组较对照组恢复提前。3、实验组和对照组动物的皮层体感诱发电位潜伏期（SSEP）间没有显著性差异，连续给药组和短期给药组间潜伏期亦无差异。4、全程给药和短期给药神经功能恢复没有显著性差异。观察期内两组动物的生存情况没有明显差别。第二部分脊髓L_4-6节段的NF-κB和IL-6 mRNA基因和蛋白表达水平统计结果：B组（坐骨神经切断缝合对照组）高于A组（无手术对照组）（P＜0.05），C组（FK506处理组）低于B组（P＜0.05），C组高于A组（P＜0.05）；C组组内比较的结果是：C2（高浓度，1mg／kg／day）的表达低于比C1（低浓度，0.5mg／kg／day），差异具有显著性（P＜0.05）。坐骨神经损伤局部的NF-κB和IL-6 mRNA基因和蛋白表达水平统计结果：B组（坐骨神经切断缝合对照组）NF-κB和IL-6 mRNA高于A组（无手术对照组）（P＜0.05），C组（FK506处理组）高于A组（P＜0.05），C组和B组间无差异（P＞0.05）。第三部分FK506可以促进神经干细胞的增殖和分化，表现在细胞的数量增加，分化的时间提前，成熟度和分化率增高。而且该效应具有浓度差异，一呈正性相关。结论第一部分1．免疫抑制剂FK506全身免疫抑制下，坐骨神经损伤大鼠肌肉重量及肌力恢复提前，肢体功能测定优于非免疫抑制状态下。2．短期给药可获得与全程给药相同效果。3．免疫抑制剂FK506短期使用不影响生存。第二部分1．坐骨神经横断伤促进损伤神经局部和对应脊髓节段NF-κB和IL-6的活化和表达。2．免疫抑制剂FK506能够明显抑制周围神经损伤促发的对应脊髓节段的NF-κB和IL-6的活化和表达，此阻断效应具有浓度相关性。3．免疫抑制剂FK506对周围神经损伤局部的NF-κB和IL-6的活化和表达上调无明显抑制作用。4．提示FK506通过阻断NF-κB信号通路，促进损伤周围的修复与再生。第三部分1．FK506可能通过神经干细胞途径促进神经的修复和再生。2．FK506可以作为一种新的神经干细胞分化因子，参与神经干细胞相关研究。