过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅激活因子1(peroxisome proliferatorsactivated receptor-γ coactivator1，PGC-1)是一种近年来引人注目的核受体辅助激活因子。它具有多功能性，广泛参与能量代谢、适应性产热、呼吸及线粒体生物合成，与糖尿病、肥胖、阿尔茨海默病(Alzheimers Disease，AD)，Huntington舞蹈病等密切相关，在代谢调节中具有重要的作用。此外，PGC-1不仅可通过促进线粒体的生物合成，维持线粒体的膜通透性和膜电位差(△ψm)，减少促凋亡蛋白的释放(如cytochrome C)，还可以上调线粒体抗氧化酶的表达、维持线粒体Ca+内稳定、延迟或减少凋亡刺激因子对caspase-9和caspase-3激活等，从而拮抗的细胞凋亡，但是在神经元凋亡中PGC-1α的信号调控尚不清楚。因此，本论文主要以低钾诱导的小脑颗粒神经元凋亡模型探讨在神经元凋亡中PGC-1α的表达及其与JNK/c-jun细胞凋亡通路的关系，进一步深入了解PGC-1α在神经元凋亡过程中的作用。　　 1.激活的JNK/c-Jun在低钾诱导的小脑颗粒神经元凋亡中的作用　　 将体外培养7天的小脑颗粒神经元，分别用25mM KCl(简称为25K)或SmMKCl(简称为5K)培养基分别处理0.5、1、2、4、6、8小时。收集蛋白进行WesternBlot分析，发现低钾处理0.5小时后JNK磷酸化水平开始升高，4小时达到最高，说明JNK被激活。为了进一步证明JNK被激活，同时检测了c-Jun磷酸化水平的变化。c-Jun是JNK的下游底物，活化的JNK能对c-Jun的63和73位丝氨酸直接磷酸化，增强其对靶基因的转录活性。结果显示，c-Jun磷酸化(Ser73)水平在低钾处理0.5小时后开始增高，4小时达到最高，与JNK磷酸化变化趋势基本一致。结果说明在低钾诱导的小脑颗粒神经元凋亡中JNK/c-Jun通路被激活。　　 为了检测JNK激活对神经元凋亡的作用，将体外培养7天的小脑颗粒神经元，分别用25K，5K，SK中加入JNK特异抑制剂SP600125处理或JNK上游激酶MLK的抑制剂CEP11004，通过检测c-Jun磷酸化水平的变化来观察SP600125或CEP11004对JNK活性抑制的效果。结果显示，SP600125(10μM)或CEP11004(2μM)均能完全阻断c-Jun磷酸化，提示JNK活性被抑制。SP600125(10μM)或CEP11004(2μM)处理后，Hoechst33258染色，倒置荧光显微镜观察并拍照，以观察核形态，细胞核固缩或碎裂记为凋亡细胞。结果显示，处理12小时后，25 K神经元的凋亡率为10.9％，低钾处理的神经元凋亡率达到48.3％，JNK抑制剂SP600125将神经元凋亡率降低至15.2％，MLK的抑制剂CEP11004将低钾诱导的神经元凋亡率降至为16.8％。JNK抑制剂SP600125和MLK抑制剂CEP11004处理的神经元凋亡率与5K组相比明显降低(P<0.05)，说明JNK/c-Jun在在低钾诱导的小脑颗粒神经元凋亡中发挥重要关键作用。　　 2.在低钾诱导的小脑颗粒神经元凋亡中PGC-1α mRNA和蛋白表达下调　　 为检测低钾诱导的小脑颗粒神经元凋亡中PGC-1α的表达变化，将体外培养7天的小脑颗粒神经元，分别用25K或5K培养基处理1、2、4、6、8小时。收集细胞进行RT-PCR，发现PGC-1α的mRNA表达在低钾处理2小时后逐渐下调，6小时已下降到对照组(25K)的61.3％； Western Blot分析，也发现在低钾处理2小时后PGC-1α蛋白表达开始下降，6小时下降到对照组的63.1％，这表明在低钾诱导的小脑颗粒神经元凋亡中PGC-1α的mRNA和蛋白表达均下调。　　 3.过表达PGC-1α可部分保护低钾诱导的小脑颗粒神经元凋亡　　 采用过表达方法观察外源性PGC-1α对CGN低钾凋亡的影响。将pCDNA3-PGC-1α质粒转染293细胞，在293细胞内验证外源性PGC-1α蛋白表达情况。pcDNA3-PGC-1α与pcDNA3.1空载体分别转染293细胞48小时后，收集蛋白用PGC-1α抗体检测蛋白表达。结果显示pcDNA3-PGC-1α可有效地表达PGC-1α蛋白，而pcDNA3.1空载体没有PGC-1α蛋白表达。　　 体外培养5天的小脑颗粒神经元，用钙磷沉淀法转染pCDNA3-PGC-1α或空质粒pCDNA3，同时共转染pEGFP质粒作为标记。48小时后换成25K或SK，12小时后Hoechst33258染色观察，倒置荧光显微镜观察并拍照，细胞核固缩或碎裂记为凋亡细胞，GFP荧光阳性细胞数计为总数，计算凋亡率。结果显示过表达pCDNA3-PGC-1α可使SK诱导的神经元凋亡率下降，其凋亡率是对照组(SK加入pCDNA3)的77.1％(P<0.05)，说明PGC-1α对神经元凋亡具有部分的保护作用。　　 4.在低钾诱导的小脑颗粒神经元凋亡中JNK/c-Jun部分介导PGC-1α的表达下调　　 为检测低钾诱导的小脑颗粒神经元凋亡中激活的JNK/c-Jun是否与PGC-1α的表达下调有关，将体外培养7天的小脑颗粒神经元分别用25K，5K，5K中加入JNK抑制剂SP600125，5K中加入MLK抑制剂CEP11004处理6小时，通过检测c-Jun磷酸化水平的变化来观察SP600125或CEP11004对JNK活性抑制的效果。结果显示，JNK上游激酶MLK的抑制剂CEP11004或JNK抑制剂SP600125(10μM)均能完全阻断c-Jun磷酸化，提示JNK活性被抑制。用RT-PCR方法检测PGC-1αmRNA水平或Western Blot方法检测PGC-1α蛋白水平，结果显示，SP600125或CEP11004能部分阻断低钾引起的PGC-1α mRNA和蛋白表达下调，这些结果提示在低钾诱导的小脑颗粒神经元凋亡中JNK/c- Jun可能部分介导PGC-1α的表达下调。　　 5.SP600125或CEP11004可部分拮抗低钾引起的PGC-1α启动子活性的抑制　　 为进一步证明JNK/c-Jun介导PGC-1α的表达下调是在转录水平，将3’-端的PGC-1α启动子区域的DNA(-1771～+30)与无启动子的荧光酶报告质粒PGL3-Basic构建成含有PGC-1α启动子的荧光酶报告质粒PGC-1α-luc。用钙磷共沉淀法分别将PGL3-Basic或PGC-1α-luc质粒与pCMV-RL质粒共转染体外培养6天的小脑颗粒神经元，12小时后分别换成25K，5K，5K中加入SP600125，5K中加入CEP11004培养基继续处理10小时，收集细胞并检测荧火虫荧光酶活性，结果显示，25K处理后PGC-1α-luc荧光酶活性比PGL3-Basic的高6.25倍，而SK处理后PGC-1α-luc荧光酶活性是25K处理的62.3％(P<0.05)，提示低钾可引起PGC-1α的启动子活性下调；5K中加入SP600125和5K中加入CEP11004处理后PGC-1α-luc荧光酶活性分别是25K处理的83.5％(P<0.05)和79.7％(P<0.05)，提示SP600125和CEP11004能部分拮抗低钾引起PGC-1α-luc荧光酶活性下调。这些结果提示在低钾诱导小脑颗粒神经元凋亡中JNK/c-Jun的激活可抑制PGC-1α启动子的活性。　　 6.用染色质免疫沉淀方法检测c-Jun与PGC-1α，启动子上CRE位点的结合　　 许多研究表明，PGC-1α启动子的MEF2和CRE保守序列在PGC-1α基因转录调节中起到非常重要的作用。为了进一步明确c-Jun抑制PGC-1α转录是否通过与PGC-1α启动子上的MEF2和/或CRE位点结合而起作用，进行了染色质免疫沉淀方法(Chromatin Immunoprecipitation assay，ChIP)。　　 用免疫共沉淀法(immunoprecipitation，IP)的方法进一步探讨c-Jun与CREB是否形成复合物，从而抑制CREB对PGC-1α的转录。　　 小结:　　 1.低钾可诱导CGNs凋亡。凋亡中JNK/c-Jun通路被激活，随后PGC-1α mRNA和蛋白表达下调。过表达PGC-1α可部分降低低钾诱导的CGNs凋亡率。这些结果提示PGC-1α表达下降可能涉及低钾诱导的CGNs凋亡。　　 2.JNK抑制剂SP600125(10μM)或JNK上游激酶MLK抑制剂CEP11004(2μM)可明显降低低钾诱导的CGNs凋亡率。SP600125或CEP11004几乎完全抑制了c-Jun的磷酸化，并可部分阻断低钾诱导的PGC-1α表达下降。含有PGC-1α启动子的报道基因结果显示，SP600125或CEP11004可部分拮抗低钾引起的PGC-1α启动子活性的抑制。这些结果提示对PGC-1α的转录调控除涉及JNK/c-Jun外，还可能有其它通路参与。　　 3.染色质免疫沉淀方法(ChIP)结果显示，低钾可诱导c-Jun与PGC-1α启动子上的CRE位点结合，不与MEF2位点结合，提示c-Jun可能与CRE位点结合后，抑制PGC-1α启动子功能，导致PGC-1α mRNA和蛋白下调。免疫共沉淀法(Co-IP)结果显示，c-Jun不与CREB结合形成复合物。c-Jun与CRE位点结合妨碍PGC-1α转录机制有待阐明。