论文部分内容阅读
目的明确在Islet-1诱导的间充质干细胞(Mesenchymal stem cells,MSCs)向心肌样细胞分化过程中组蛋白甲基化/乙酰化和DNA甲基化修饰在调控心肌早期转录因子表达中的作用,鉴定出三种修饰参与调控这些因子的关键酶,并初步探明这些关键酶在调控心肌早期转录因子过程中交互作用的机制。为提高MSCs向心肌细胞的分化率以更好地应用于临床治疗心血管疾病打下重要的实验基础。方法1.染色质免疫共沉淀(Chromatin immunoprecipitation q PCR,Ch IP-q PCR)检测转染GATA4和Nkx2.5启动子区组蛋白乙酰化/甲基化水平,以及三种修饰的关键酶与这些区域的结合情况2.甲基化特异性PCR(Methylation-Specific PCR,MSP)用以初步检测GATA4和Nkx2.5启动子区的DNA甲基化水平3.亚硫酸盐测序(bisulfite sequencing PCR,BSP)对MSP中DNA甲基化水平变化明显的样本进行验证4.荧光定量PCR(fluorescence quantitative PCR,FQ-PCR)检测GATA4和Nkx2.5的m RNA表达水平5.Western blot检测组蛋白甲基化/乙酰化和DNA甲基化修饰各自发挥作用的关键酶表达情况、6.免疫荧光检测心肌特异蛋白c Tn T和缝隙连接蛋白Cx43的表达,以验证MSCs是否向心肌样细胞分化结果1.在Islet-1诱导的分化过程中,GATA4启动子区第二位点组蛋白乙酰化水平逐渐升高,而组蛋白甲基化和DNA甲基化水平逐渐降低;Nkx2.5启动子区组蛋白乙酰化/甲基化水平与其在GATA4启动子区的趋势一致,但DNA甲基化水平在整个分化过程中没有改变2.Islet-1诱导同时用5-aza改变DNA甲基化水平,可以引起GATA4启动子区第二位点组蛋白乙酰化升高和组蛋白甲基化水平降低,但是无法改变Nkx2.5启动子区的组蛋白乙酰化/甲基化水平3.Islet-1诱导同时用TSA改变组蛋白乙酰化水平,GATA4启动子区第二位点的组蛋白甲基化水平和DNA甲基化水平都明显降低,而Nkx2.5启动子区仅表现出组蛋白甲基化水平降低4.Western blot检测发现Islet-1诱导分化过程中三种表观遗传修饰的关键酶有明显变化的有Gcn5、P300、HDAC1、G9A、DNMT-1和DNMT-3a5.Ch IP-q PCR检测出与GATA4和Nkx2.5启动子区结合的关键酶主要有Gcn5、HDAC1、G9A、DNMT-1,另外HP1-α和HP1-β也结合在这些区域;DNMT-1、HP1-α和HP1-β虽然与Nkx2.5有结合,但在整个分化过程中结合水平并没有变化6.与Islet-1诱导组相比抑制Gcn5后GATA4和Nkx2.5的表达水平明显降低,且没有出现c Tn T和Cx43的表达,表明抑制Gcn5能够阻止MSCs向心肌样细胞分化7.抑制Gcn5后,与Islet-1诱导组相比HDAC1、G9A、HP1-α、HP1-β和DNMT-1与GATA4启动子区的结合都明显升高,且该区域的组蛋白乙酰化水平显著降低,组蛋白甲基化和DNA甲基化水平明显升高;而HP1-α、HP1-β和DNMT-1与Nkx2.5的结合没有受到Gcn5被抑制的影响,因而DNA甲基化水平与Islet-1诱导组相比没有明显改变结论Islet-1促MSCs分化过程中,Islet-1引导组蛋白乙酰转移酶Gcn5与心肌早期转录因子结合,并连同组蛋白乙酰化/甲基化和DNA甲基化在心肌特异转录因子的启动子区形成一种“环形”交互作用,共同调控该转录因子的表达,从而促进MSCs向心肌样细胞分化