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本文确证了10个禾谷镰孢菌供试菌株对多菌灵的敏感性。西株ZF43、ZF2032、No.2021和诱导低抗菌株ZF43-2(MBCLR)对MBC的ECso分别为0.5411、0.6288、0.5574和0.8015μg/mL,敏感菌株(MBCs)在1.4μa/mL MBC浓度下不能生长,但低抗菌株ZF43-2能够生长,10μg/mL浓度下完全抑制。中抗菌株(MBCMR)ZF52、ZF2054和No.2458在10μg/mL MBC浓度下生长快速,501μg/mL生长缓慢,1001.μg/mL浓度下完全抑制。诱导高抗菌株(MBCIHR)ZF43-2-5、ZF52-7和田间高抗菌株((MBCHK)JT04对MBC的EC50分别为4.72G/mL、20.6620μg/mL和20.94951μg/mL,在50μg/mL MBC浓度下生长较快,1001μg/mL浓度下生长缓慢。 用单独和混合培养的方法研究了在乏营养条件下禾谷镰孢菌MBCMR菌株No.2458和MBCs No.2021间产孢竞争作用。结果表明在单独培养时,抗性菌株No.2458在前期产孢(从开始一峰值,下同)以Y=1.00×104+36.45T2、后期(从峰值—473.5h,下同)以Y=1.33×106-6.65×103T+8.59T2抛物线方式消长;而敏感菌株No.2021前期以Y=9.98×106+4.82×104T的直线方式、后期以Y=2.78×107-9.28×104T+1.00×102T2的抛物线方式消长;在1:1混合培养条件下,敏感菌株和抗药菌株产孢模型分别为NΣs=-2.99×103+6.45×102T-1.13T2和NΣr=-1.43×105+2.64×104T-46.09T2,并表现为敏感菌株No.2021在42.5~190h处于产孢竞争优势,抗性菌株在190~474.5h处于产孢竞争优势,产孢总量表现颉颃作用。敏感菌株在混合培养时产孢高峰时刻与其在单独培养时的相同,而抗药性菌株在混合培养时产孢高峰时刻比其在单独培养时的产孢峰值时刻提前24h。 以禾谷镰孢菌MBCs菌株ZF43和ZF2032、MBCLR菌株ZF43-2、MBCMR菌株ZF52、MBCHR菌株JT04和MBCIHR菌株ZF43-2-5为材料,根据参考菌株NRRL31084(PH-1)γ-、α-、α2-微管蛋白基因和微管相关蛋白基因(map)的全序列分别设计了5对、4对、4对、4对引物,采用PCR方法分段扩增,获得了它们的全序列。 γ-微管蛋白基因全长1868bp,含有5个内含子,编码493 aa。6个测试菌株的γ-微管蛋白基因核苷酸序列与NRRL3 1084的同源性为99%,存在10个核苷酸差异,氨基酸序列同源性100%。但表现对多菌灵敏感、低抗、中抗、高抗的6个菌株的核苷酸序列及其编码的γ-微管蛋白完全一致,证明病菌对多菌灵的敏感性差异与γ-微管蛋白基因无关。 α-微管蛋白基因全长1718bp,含有6个内含子,编码449 aa。α-微管蛋白基因核苷酸序列与NRRL31084的同源性99%,存在5个核苷酸差异,氨基酸序列同源性99.78%,与其他8种真菌α-微管蛋白基因氨基酸序列同源性37~86%。说明不同种真菌α-微管蛋白结构存在较大变化,禾谷镰孢菌种内中国菌株与美国菌株PH-1也存在一个氨基酸差异,但是,测定的6个敏感、低抗、中抗、和高抗菌株之间没有差异,说明病菌对多菌灵的敏感性差异与α-微管蛋白基因无关。 α2-微管蛋白基因全长1713bp,含有4个内含子,编码453 aa。α2-微管蛋白基因核苷酸序列与NAIW3*84的同源性99%,存在5个核苦酸差异,氨基酸序列同源性100%与该菌 a微管蛋白基因氨基酸序列同源性 69%,而与该菌微管蛋白基因家族中其他微管蛋白基因氨基酸序列的同源性27~39%与其他吕种真菌a一微管蛋白基因氨基酸序列同源性64~89%。说明病菌对多菌灵的敏感性差异与a*微管蛋白基因无关。 微管相关蛋白基因(mop)全长1793hp,含有6个内含子,编码199aa。与参考菌株的mop基因相比较,存在 10个核着酸差异,氨基酸序列同源性 100%,与其他 8个物种 mop基因氨基酸序列同源性5~14%。说明病菌对多菌灵的敏感性差异与微管相关蛋白基因无关。 同理,应用 2对引物,从禾谷镰抱菌 MBCS菌株 ZF43和田2032、m吵R菌株 ZF52P ZF2054、MBCH”菌株 JT04 $0室 MBC‘HR菌株 ZF43-2-5分段扩增,获得了未命名微管蛋白基因全序列。该基因全长997hp,含有 1个内含子,编码313aa,MBCS菌株的未命名微管蛋白基因与Nlllth31 084的未命名微管蛋白基因核着酸序列同源性99.3%,存在7个核着酸差异,氨基酸序列同源性 100%,与其他常见真菌产一微管蛋白基因氨基酸序列同源性 70~78%。2个 MBC’菌株和 4个抗药菌株的未命名微管蛋白基因氨基酸序列分析表明,MBCM’菌株的未命名微管蛋白基因编码的第 33位苯丙氨酸(W)突变为酪氨酸(TAT);MBCHR菌株的未命名微管蛋白基因编码的第 64位谷氨酸(GAG)突变为亮氨酸(Cm);MBC‘脱菌株的未命名微管蛋白基因编码的第 64位谷氨酸(GAG)突变为赖氨酸(AAG)。 利用抑用性扣除杂交(suppressive subtraction hybridization,SSH)技术,以10个MBC““禾谷镰抱菌菌株的叨NA作为试验方Oester人 以 9个 MBC’禾谷镰抱菌菌株为驱动方uriver),制备正向抑制性扣除 cDNA,连接到 pMD1载体,转化到 DHS a,获得正向抑制性扣除CDNA文库,以获取禾谷镰抱菌株对多菌灵产生抗药性的相关基因:以9个MBCS禾谷镰抱菌株为试验方hester人 以 10个 MBCm禾