【摘 要】
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真菌天然次生代谢产物活性丰富、结构多样,在人类、动植物医药方面扮演重要角色。然而研究发现多数微生物生物合成基因簇在常规的实验室条件下并不表达。在本课题组前期工作中,我们发现毛韧革菌（Stereum hirsutum）中的5个PKS生物合成基因簇可能处于低表达或者沉默状态,本论文中,我们选取其中一个PKS5生物合成基因簇为研究目标,在尿嘧啶、尿苷营养缺陷型构巢曲霉（Aspergillus nidul
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真菌天然次生代谢产物活性丰富、结构多样,在人类、动植物医药方面扮演重要角色。然而研究发现多数微生物生物合成基因簇在常规的实验室条件下并不表达。在本课题组前期工作中,我们发现毛韧革菌（Stereum hirsutum）中的5个PKS生物合成基因簇可能处于低表达或者沉默状态,本论文中,我们选取其中一个PKS5生物合成基因簇为研究目标,在尿嘧啶、尿苷营养缺陷型构巢曲霉（Aspergillus nidulans）菌株中实现异源表达。首先,由于涉及大片段DNA的重组及异源表达,并考虑到表达质粒的稳定性和承载力,以构巢曲霉遗传信息为基础,对p SMART BAC母载体进行优化改造,在p SMART BAC上整合组成型启动子gal A、构巢曲霉AMA1自主复制元件、pry G（orotidine-5’-phosphate decarboxylas）蛋白基因以及潮霉素抗性基因,构建p SMART FAC母载体,并将其重命名为pYUZ299。该穿梭质粒可以装载完整PKS5基因簇,并可在大肠杆菌中进行表达载体的构建和用于丝状真菌中异源表达。然后,构建毛韧革菌（Stereum hirsutum）的基因组文库,从中筛选出含有完整PKS5基因簇的克隆子,使用Red/ET同源重组系统,介导线性穿梭质粒pYUZ299与环状BAC文库质粒之间的线环重组以获得表达质粒pYUZ301。最后,酶解构巢曲霉分身生孢子或菌丝,获得原生质体;采用PEG-Ca Cl2介导原生质体转化的方法,在获得携带表达质粒pYUZ301的构巢曲霉菌株的同时,获得携带母载体pYUZ299的构巢曲霉对照组。我们将获得的阳性转化子用于后续的产物检测,在液体YMG培养基的发酵产物中检测到了对照组中并未出现的三个新分子离子峰。
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