论文部分内容阅读
饥饿疗法通过切断肿瘤营养供应饿死肿瘤细胞,是一种成熟的肿瘤治疗方法。但是,肿瘤在饥饿状态下会引起轻度保护性自噬,导致饥饿疗法治疗效果减弱。在饥饿治疗的同时,如果能够调节自噬程度,诱导过度自噬,不仅能提高饥饿疗法的治疗效果,还能诱导自噬性细胞死亡,实现增强的抗肿瘤效应。基于上述分析,本文构建一种转变自噬程度的Cur@MOF-GOx/HA纳米递送系统,透明质酸（HA）特异性识别肿瘤细胞表面高表达CD44受体使纳米递送系统靶向肿瘤部位。葡萄糖氧化酶（GOx）催化葡萄糖生成H2O2和葡萄糖酸,在诱导肿瘤细胞饥饿的同时,为金属有机框架（MOF）介导的芬顿（Fenton）反应提供反应物H2O2,诱发化学动力学疗法（CDT）,生成高毒性的·OH。更重要的是,由饥饿疗法引起的轻度保护性自噬可以被姜黄素（Cur）转化为重度杀伤性自噬,增强肿瘤饥饿治疗效果。主要研究内容及结果如下:1.Cur@MOF-GOx/HA纳米递送系统的制备与表征首先,通过水热法合成MOF,通过傅里叶红外光谱分析、X射线光电子能谱分析和热重分析表征MOF的成功合成,氮气吸附-解析附实验结果表明MOF的表面积约为26.4±0.5 m~2/g,平均孔径约为7.6±0.2 nm,适于表面改性和药物的负载。然后,通过酰胺键将GOx固定在MOF表面,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳实验表征GOx的成功固定,BCA蛋白定量试剂盒测得GOx负载率约为52.6±4.3μg/mg。最后,在MOF介孔中负载Cur,并在最外部修饰HA,最终制备为Cur@MOF-GOx/HA纳米递送系统。粒度分析和透射电镜结果表明Cur@MOF-GOx/HA纳米递送系统是粒径约为220.7±2.3 nm的双锥六棱柱结构。紫外分光光度计测得Cur的载药率约为20.5±0.6%,包封率约为76.8±2.3%。2.Cur@MOF-GOx/HA纳米递送系统体外性质的考察首先,通过不同指示剂表明载体MOF具有类过氧化物酶活性,能够催化H2O2生成·OH。然后,通过葡萄糖酸生成、H2O2生成和葡萄糖消耗等实验证明GOx固定在MOF表面仍能保持原有的活性。其次,通过透析法考察Cur的体外释放行为,结果表明Cur@MOF-GOx/HA纳米递送系统可以响应肿瘤细胞的微酸性环境释放Cur,72 h的累积释放率可达82.5±3.1%。最后,稳定性实验初步表明纳米递送系统在PBS溶液和细胞培养基中均具有良好的稳定性,体外溶血实验表明纳米递送系统具有较好的生物相容性。3.Cur@MOF-GOx/HA纳米递送系统的体外抗肿瘤活性研究以乳腺癌细胞4T1作为体外抗肿瘤活性研究的模型。首先,通过激光共聚焦显微镜和流式细胞术考察4T1细胞对纳米递送系统的摄取情况,结果表明纳米递送系统通过CD44受体介导的内吞作用被肿瘤细胞摄取,6 h的摄取率达到74.9±2.3%。其次,采用磺酰罗丹明B法考察不同纳米粒对4T1细胞的毒性,结果表明MOF-HA对正常细胞具有良好安全性。此外,MOF-HA通过Fenton反应生成·OH对肿瘤细胞生长有一定抑制作用。Cur@MOF-GOx/HA纳米递送系统可有效杀伤4T1细胞。ROS和H2O2检测结果表明Cur@MOF-GOx/HA纳米递送系统能在肿瘤细胞中诱发CDT,生成ROS。然后,蛋白免疫印迹实验表明纳米递送系统能够诱导肿瘤细胞凋亡。最后,通过蛋白免疫印迹实验、免疫荧光实验、透射电镜实验和Ad-m Cherry-GFP-LC3B双荧光检测实验考察肿瘤细胞自噬情况,结果表明纳米递送系统能够诱导肿瘤细胞发生重度自噬。4.Cur@MOF-GOx/HA纳米递送系统的体内抗肿瘤活性研究以荷4T1细胞的雌性BALB/c小鼠为模型,考察纳米递送系统的体内抗肿瘤活性。首先,活体荧光成像实验表明纳米递送系统对肿瘤部位具有良好的靶向性。其次,对小鼠进行14天的治疗,肿瘤组织H＆E染色和肿瘤相对体积变化结果均表明Cur@MOF-GOx/HA纳米递送系统具有较好的抑制肿瘤生长能力,肿瘤抑制率达到70.5±2.3%。然后,冰冻切片实验表明Cur@MOF-GOx/HA纳米递送系统在肿瘤组织中产生大量ROS。免疫荧光实验和透射电镜实验结果均表明纳米递送系统能够诱导肿瘤细胞发生重度自噬。最后,小鼠体重变化、小鼠组织病理切片、血常规和血生化的检测结果初步表明Cur@MOF-GOx/HA纳米递送系统具有较好的生物安全性和生物相容性。以上研究表明,本文构建的纳米药物递送系统,能够将饥饿疗法引起的轻度保护性自噬转化为重度杀伤性自噬,增强肿瘤饥饿治疗效果。同时通过CDT在肿瘤细胞中生成大量ROS,协同抑制肿瘤细胞生长。