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近年许多研究揭示了 microRNA(miRNA,微小RNA)在糖尿病肾病(diabetic nephropathy,DN)进展中的重要作用。已经证实miR-27a在DN表达上调,但其调节肾小管间质纤维化(tubulointerstitial fibrosis,TIF)的具体机制尚不清楚。本研究拟通过细胞实验、动物实验及DN患者研究探讨miR-27a/PPARγ轴在其中的作用及可能的分子机制,为肾纤维化的防治措施提供新的依据和途径。第一章高糖条件下NRK-52E细胞miR-27a表达的变化及对纤维化的影响[目的]观察高糖条件下NRK-52E细胞miR-27a表达的变化及对纤维化的影响。[方法]将NRK-52E分Mannitol、NG、HG三组,分别用含甘露醇30mmol/L和含糖5mmol/L、30mmol/L的DMEM/F12完全培养基培养。qRT-PCR法检测各组在不同时间点(12、36和72h)及含糖组在不同糖浓度(5mmol/L、15mmol/L、30mmol/L)时miR-27a、PPARγ、TGF-β1、Smad3、CTGF、FN、ColⅠ 的mRNA,Western blot检测其蛋白表达,荧光素酶报告基因检测PPARγ-3’UTR的荧光素酶活性。[结果]HG组miR-27a及TGF-β1、p-Smad3、CTGF、FN、Col Ⅰ 表达上调,PPARy表达下调,且为miR-27a的直接靶基因。[结论]高糖增加miR-27a表达,后者通过抑制PPARy而诱导NRK-52E纤维化。第二章上调或下调表达miR-27a对高糖条件下NRK-52E纤维化的影响[目的]探讨上调或下调表达miR-27a对高糖条件下NRK-52E细胞纤维化的影响。[方法]以HG组NRK-52E为研究对象,应用脂质体转染技术将外源性miR-27a抑制剂(miR-27ai)、miR-27a 类似物(miR-27am)、PPARy siRNA 及相应对照物瞬时转染NEK-52E,PPARγ激动剂罗格列酮(Rosi.)及对照物预处理细胞,将其分九组:(1)miR-27ai和相应对照组(miR-iNC);(2)miR-27am和相应对照组(miR-NC);(3)PPARysiRNA 和相应对照组(NTsiRNA);(4)Rosi.和相应对照组(DMSO);(5)PPARy siRNA+miR-27ai 组。qRT-PCR、Western blot 和间接细胞免疫荧光检测 PPARγ、TGF-β1、Smad3、CTGF、FN、Col Ⅰ的mRNA和蛋白表达。[结果]高糖条件下,miR-27am 下调 PPARy 表达,上调 TGF-β1、p-Smad3、CTGF、FN、ColⅠ表达,miR-27ai则作用相反。PPARγsiRNA和miR-27ai共转染,可增加PPARy表达。[结论]PPARγ作为miR-27a的直接靶基因,通过抑制TGF-β1/Smad3通路而减轻NRK-52E纤维化。第三章STZ糖尿病大鼠模型miR-27a表达的变化及对TIF的影响[目的]观察STZ糖尿病大鼠模型血浆和肾组织中miR-27a表达的变化及对TIF的影响。[方法]STZ糖尿病大鼠腹腔注射miR-27ai或miR-27am后分6组:(1)正常对照组(NC);(2)糖尿病造模组(DM);(3)DM_miR-27ai和相应对照组(DM_miR-iNC):(4)DM_miR-27am 和相应对照组(DM_miR-NC)。持续干预至12周后处死。qRT-PCR检测大鼠血浆及肾脏miR-27a,Western blot及免疫组化检测肾组织 PPARγ、TGF-β1、p-Smad3、CTGF、FN、Col Ⅰ 的表达;Masson三色染色观察肾组织病理改变。大鼠Scr、BUN、尿NAG、UAER,UACR、Ccr等肾损害相关指标均被分析。[结果]STZ大鼠血浆及肾组织miR-27a表达上调,抑制miR-27a能上调PPARy,减轻TIF及降低肾损害相关指标。激活miR-27a则结果相反。[结论]miR-27a/PPARγ轴通过激活TGF-β1/Smad3信号启动STZ糖尿病大鼠TIF进程。第四章DN患者血浆miR-27a表达的变化及对TIF的影响[目的]观察DN患者血浆miR-27a表达的变化及对TIF的影响。[方法]选取行肾活检的DN患者52例。免疫组化分析其肾组织PPARγ、TGF-β1、p-Smad3、CTGF、FN、Col Ⅰ的表达,Masson三色染色观察TIF的病理改变。收集DN患者及健康志愿者血标本各30例,qRT-PCR法检测其血浆miR-27a,并分析其与24h尿蛋白定量、尿NAG、Scr及eGFR等肾损害相关指标的相关性。[结果]DN患者血浆miR-27a表达上调,且与Scr、24h尿蛋白定量及尿NAG呈正相关,与eGFR呈负相关。伴随TIF的加重,PPARγ表达下调。[结论]DN患者血浆miR-27a升高反应肾功能恶化及TIF加重,其机制可能是通过PPARγ诱导的TGF-β1/Smad3通路的激活。