目的：　　艾滋病是威胁人类健康的重大传染性疾病，据估计中国已有艾滋病病毒感染者和艾滋病患者74万，其中艾滋病患者10.5万，艾滋病流行和防治形势依然严峻。艾滋病尚无治愈方法，高效抗逆转录病毒治疗（Highly Active AntiretroviralTherapy, HAART）是目前最有效治疗艾滋病并控制HIV传播的方法。然而，随着HAART的广泛应用，新的耐药变异在不断出现，HIV耐药日趋严重，已成为全球关注的公共卫生热点问题。　　南非、乌干达及巴西等地的研究发现， HAART治疗病毒学失败的HIV-1感染者出现耐药突变的比例在86％以上，耐药突变位点随着治疗时间延长而逐渐增多。我国在2002年启动了艾滋病免费抗病毒治疗，随着我国免费抗病毒治疗的推广，全国接受抗病毒治疗的艾滋病人累计已接近10万人，随着治疗时间延长，耐药率也在逐年增加，但目前报道的多为治疗时间在2-3年内的耐药研究，对于治疗时间3年以上的治疗失败患者的耐药情况尚无报道。在我国长期服用一线抗病毒治疗方案的艾滋病人治疗失败后，耐药突变率是否仍持续上升？与治疗时间短的患者相比较是否出现更多的耐药突变位点？更多耐药位点的出现能否用现有的耐药数据库系统进行解释？这些问题都尚无报道。　　HIV-1耐药性检测方法主要有基因型检测和表型检测两种。基因型检测是目前全球普遍采用的方法，它通过扩增病毒的耐药相关基因序列后提交到斯坦福HIV耐药数据库判断病毒的耐药性。这种方法的优点是简单、快速、费用低，缺点是仅是一种间接、定性判断耐药性的方法，是利用耐药数据库对耐药表型的一种预测。表型耐药检测通过测定不同药物浓度下病毒的复制能力来检测病毒对药物的敏感性，能定量进行药物敏感性判断，是对病毒耐药性进行分析的标准方法。该方法检测的是不同耐药突变相互作用的净效应，能够直接判断毒株的耐药性，可以弥补基因型耐药检测的不足，提供更为可靠的耐药信息。基因型耐药与表型耐药检测结果不一致时，国际上通常以表型耐药检测结果为准。以往都用活病毒进行表型耐药检测，由于活病毒表型耐药检测耗时、费力、实验室条件要求过高，目前国外正在开发假病毒表型耐药检测方法，已逐渐发展成为国际普遍采用的表型耐药检测方法，国内尚无应用假病毒对HAART治疗失败人群进行表型耐药的研究报道。　　综上所述，本研究选取长期服用一线抗病毒治疗方案后病毒学失败的患者，进行基因型耐药检测，明确该人群耐药变异情况;建立假病毒表型耐药检测方法，对上述病例进行假病毒表型耐药检测，与基因型耐药检测结果进行比较分析;进一步应用活病毒表型耐药检测方法验证假病毒表型耐药方法的有效性，以期寻找适合长期抗病毒治疗后病毒学失败患者的耐药检测方法。　　方法：　　1、研究对象　　研究对象入选标准:接受HAART治疗3年以上，并根据《艾滋病诊疗指南》中病毒学失败的标准，同时符合下列任一条件者即符合入选标准:　　(1)经HAART后血浆中病毒载量没有降至“测不出(＜400copies/ml)”的水平;　　(2)血浆中病毒载量经HAART治疗已达到“测不出(＜400copies/ml)”的水平后又出现明显反跳;　　选取河南及辽宁地区27名长期治疗失败病例，按照知情同意的原则，以统一的问卷逐一进行咨询访谈，在采集流行病学资料的同时对病人进行临床体检并以EDTA-3K抗凝管采集HIV-1感染者外周静脉血。抗凝血于24小时内测定CD4+T淋巴细胞数，全血经常规离心分离血浆，分装后-80℃冻存用于病毒载量和基因型耐药的测定。　　经构建进化树分析，2例取自辽宁的B亚型与河南的B亚型遗传距离接近，且存在多个耐药突变位点，其表型耐药检测结果可适用于河南B亚型病例的表型耐药分析。　　2、CD4+T细胞绝对值的检测　　应用美国BD公司的流式细胞仪(FACS CALIBUR)测定CD4+、CD8+、CD3+T淋巴细胞绝对值。将20μl CD4/CD8/CD3 TRITEST试剂加入CD4绝对计数管，加入50μl抗凝血，室温避光15min，加入免洗溶血素450μl，室温避光15min，FACSMULTISET软件检测并进行自动分析。　　3、病毒载量测定　　以200μl血浆采用标准版模板制备法提取RNA，采用Roche公司HIV-1Monitor(1).5 commercial kit在COBASAMPLICOR自动载量仪上以RT-PCR方法测定病毒载量。检测范围为400-750000copies/ml。　　4、病毒核酸提取　　以140μl血浆提取病毒基因组RNA，按照QIAamp Viral RNA Mini Kit说明书步骤提取RNA，提取物溶于60μl洗脱液中。　　5、耐药株基因变异的测定　　RNA逆转录PCR和套式PCR方法，以外侧引物对:yp-1(5-GCAAGAGTTTTGGCTGAAGCAATGAG-3 HIV-1 HXB21867-1892nt)和yp-2(5-CCTTGCCCCTGCTTCTGTATTTCTGC-3 HIV-1HXB23528-3553nt);内侧引物对:yp-3(5-TGCAGGGCCCCTAGGAAAAAGGGCTG-3 HIV-1HXB22002-2027nt)和yp-4(5-CATGTACCGGTTCTTTTAGAATCTCTCTGTT-3 HIV-1 HXB23465-3495nt)用于扩增HIV-1蛋白酶1-99氨基酸和逆转录酶1-240氨基酸的编码区序列。　　6、PCR反应产物纯化　　取终产物5μl进行1％琼脂糖凝胶电泳，经凝胶成像后与marker比对，确认所需片段，用QIAquick Gel Extraction Kit试剂盒纯化基因片段。　　7、病毒分离　　感染者PBMC用Ficoll-Hypaque密度梯度分层液分离，并与至少两个正常人的经植物凝集素(PHA)(5μg/ml)刺激2-3天的PBMC共培养法复制病毒。每3-4天换液1次，每7天添加1次经PHA刺激生长3天的正常人PBMC。定期对培养细胞上清中的病毒p24抗原含量进行检测，按照说明书操作，对检测阳性的病毒进行扩大培养。所分离的病毒冻存于液氮中备用。　　8、TA克隆　　扩增的pol基因1494bp片段插入克隆载体pMD-18载体，转入化学感受态菌DH5α扩大培养，然后提取质粒DNA进行双脱氧终止法测序。　　9、带有患者POL基因片段的嵌合质粒构建　　取含患者来源的pol基因片段的TA克隆质粒，进行ApaⅠ/AgeⅠ双酶切，同样将pNL4-3-dE-EGFP质粒经双酶切获得缺失gag-pol区段目标片段的空载体。用T4DNA连接酶连接酶切产物，然后转化感受态细胞DH5α、涂板和挑选克隆增菌实验，从增菌液中提取重组质粒DNA，并进行测序鉴定。　　10、功能性假病毒的获得　　将带有病人HIV-1 pol基因片段的重组质粒pNL4-3-dE-GFP和pVSV-G质粒通过Fugene HD转染试剂共转染293T细胞，37℃培养48小时，吸出细胞培养板中的上清，经0.45μm滤器过滤去掉细胞碎片即获得假病毒。　　11、假病毒及活病毒耐药性检测　　将梯度稀释的药物在假病毒或真病毒感染受体细胞TZM-bl时加入到培养液中，干扰病毒的感染过程。继续培养48小时后，利用荧光素酶检测系统测定每孔的荧光信号值以检测耐药表型。　　12、耐药判定标准和耐药数据分析:　　基因型耐药判定标准:根据斯坦福耐药网站评分系统进行基因型耐药药物耐受程度评估，0-9分:敏感(S);10-14分:潜在耐药(P);15-29分:低度耐药(L);30-59分:中度耐药(I);＞60分，高度耐药(H)。　　表型耐药判定标准:临床病毒IC50与野生株IC50相比，根据倍数变化(FoldChange，FC)判断临床病毒耐药水平。根据IC50倍数变化将病毒耐药水平分为敏感(S∶ FC＜4倍)和耐药(R)两类，耐药又分为中度耐药(I∶FC4-10倍)和高度耐药(H∶FC＞10倍)。　　所有药物浓度均转化为log10浓度值，每一浓度样品孔均计算平均RLU值，计算每一浓度样品荧光抑制率，计算公式:　　药物抑制率(％)=[1-（加药孔发光值-细胞对照孔发光值）/（病毒对照孔发光值-细胞对照孔发光值）]×100％。　　数据分析利用Graphpad Prism V5.0软件，采用非线性回归分析中四参数S型剂量方程分析每种药物的IC50值。　　13、统计学分析:　　所有资料采用SPSS11.5软件分析，数据处理成均值±标准差。统计概率采用四格表精确概率检验，p＜0.05时有统计学意义。　　结果：　　一、长期抗病毒治疗失败人群基因型耐药研究结果　　1、研究对象的人口学、病毒学和免疫学特征:　　27例治疗失败病例中男性16例，占59.3％，女性11例，占40.7％;平均年龄44±7岁。研究对象全部为汉族。HIV-1均为B亚型。至检测时，平均服药时间为60±10月。27例患者的CD4计数为241±155个/μl，病毒载量为4.4±0.8 log10copies/ml。　　2、耐药相关位点:　　27例患者100％检测出NNRTI耐药相关突变，突变位点及频率分别为K103N(40.7％,11/27)、Y181C(25.9％,7/27)、G190A(22.2％,6/27)、K101E、 K238T(11.1％，3/27)和Y188L(7.4％，2/27)。其中23例(85.2％，23/27)检测出NRTI耐药相关突变，突变位点为M41L(59.3％，16/27)、T215Y(44.4％，12/27)、L210W(40.7％,11/27)、K70R(33.3％,9/27)、M184V(29.6％,8/27)、D67N(25.9％,7/27)以及L74V(22.2％，6/27)。与治疗时间在3年以内的患者相比，检测到未见文献报道的K219N、V90I、V106I和H221C耐药突变位点。27例患者均未检出PI耐药相关主要突变，其中11例(40.7％，11/27)检测出PI耐药相关次级突变，其中以A71T(81.8％，9/11)出现的频率最高。　　3、对抗病毒药物的敏感性:　　对NNRTIs呈高水平耐药，对NVP和EFV的耐药率高达96.3％，对其他几种纳入免费抗病毒治疗的NRTIs耐药率分别为:3TC:66.7％，AZT:77.8％, d4T:77.8％, ddI:81.5％。　　二、假病毒表型耐药研究结果　　1、重组质粒测序结果:　　27例病例均获得重组质粒。用重组质粒与pVSV-G质粒共转染293T细胞，有16例获得具有感染性的假病毒。对16例重组质粒测序，有2例患者质粒在逆转录酶区测序结果与PCR产物测序结果略有差异，但提交斯坦福耐药数据库后耐药预测无差异。对质粒测序结果与PCR产物测序结果构建系统进化树，发现PCR产物与重组质粒遗传距离非常接近。　　2、基因型耐药检测结果:　　100％(16/16)患者对至少一种逆转录酶药物耐药，其中93.8％(15/16)对NNRTI耐药，对NRTI的耐药率分别为:3TC:56.3％，AZT:75.0％，d4T:75.0％,ddI:75.0％。　　3、用假病毒表型耐药方法检测结果:　　100％(16/16)患者对至少一种逆转录酶药物耐药，其中87.5％(14/16)对NNRTI耐药，对NRTI的耐药率分别为:3TC:93.8％，AZT:68.8％，d4T:43.8％，ddI:56.2％。　　4、表型耐药检测与基因型耐药检测的关系:　　通过比较表型和基因型耐药检测结果可以发现，对于ddI、3TC、d4T、AZT和EFV五种药物，分别有50％(8/16)、37.5％(6/16)、31.3％(5/16)、18.8％(3/16)和18.8％(3/16)的基因型和表型耐药结果不一致。统计学分析显示，二者差异无统计学意义。对于3TC，6例均为基因型敏感而表型耐药。对于d4T，5例均为基因型耐药而表型敏感。对于AZT和EFV，分别有2例为基因型耐药而表型敏感，另有1例为基因型敏感而表型耐药。对于ddI，有5例为基因型耐药而表型敏感，而另外3例为基因型敏感而表型耐药。　　三、活病毒表型耐药研究结果　　1、基因型耐药结果:　　4例患者均检出NRTI或NNRTI耐药突变。300149对AZT、d4T和EFV耐药，对3TC和ddI敏感;300180对AZT、d4T、3TC和ddI敏感，对EFV耐药;300130对AZT、ddI和d4T敏感，对3TC和EFV耐药;300494对ddI、d4T、AZT、3TC和EFV均耐药。　　2、实验室适应毒株表型耐药检测:　　用实验室适应毒株SF33来检测TZM-bl细胞方法的敏感性，每次实验重复2次，利用Graphpad Prism V5.0软件计算每种药物对病毒的IC50。AZT、ddI、d4T、ddI、3TC以及EFV对SF33毒株的IC50分别为(0.004±0.001)μM、(2.66±0.08)μM、(0.139±0.037)μM、(0.392±0.008)μM、(0.078±0.007)μM。　　3、病毒株的表型耐药结果:　　300149和300180对AZT、d4T和3TC敏感，对ddI和EFV耐药;300130对AZT和d4T敏感，对ddI、3TC和EFV耐药;300494对ddI和d4T敏感，对AZT、3TC和EFV耐药。　　4、活病毒表型耐药与基因型耐药结果比较:　　ddI:100％不一致，d4T:50％不一致，AZT:25％不一致，EFV和3TC的结果无不一致。　　5、活病毒与假病毒表型耐药性结果比较:　　分别检测两株病毒对五种药物的表型耐药，共得到10个结果，其中9个结果在耐药解释及耐药程度上均高度一致，仅300494毒株对于AZT的耐药结果存在程度上的差异（假病毒方法为中度耐药，而活病毒方法为高度耐药）。　　结论：　　1、我国抗病毒治疗平均5年以上病毒学失败艾滋病患者耐药突变率为100％，显著高于国内治疗时间在3年以内的人群的耐药突变率。该人群对NNRTI和NRTI均呈高水平耐药。出现频率较高的耐药突变为M41 L(59.3％)、T215Y(44.4％)、L210W(40.7％)、K103N(40.7％)和K70R(33.3％)。与国内治疗时间在3年以内的患者相比，检测到未见文献报道的K219N、V90I、V106I和H221C耐药突变位点。未发现蛋白酶抑制剂主要耐药突变。　　2、在国内首次应用假病毒的方法对我国长期抗病毒治疗后病毒学失败艾滋病患者共16株病毒的表型耐药进行了检测，发现基因型耐药检测与假病毒表型耐药检测存在不一致的结果。现有的斯坦福耐药数据库不能对我国长期抗病毒治疗失败患者的基因型耐药检测结果给予完全合理的解释。假病毒表型耐药检测对于感染非B亚型HIV-1且具有复杂耐药突变位点艾滋病患者的耐药性能够提供更为可靠的耐药信息，有效指导临床治疗。　　3、经活病毒表型耐药方法验证假病毒方法可以代替活病毒方法进行表型耐药检测。假病毒表型耐药检测方法是适用于我国长期抗病毒治疗失败艾滋病患者的耐药检测方法。