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限制性内切酶Dpn I又名DNA腺嘌呤甲基化酶,是一种能在一限定数目的专一部位上分裂脱氧核糖核酸分子的酶,酶名称为：E.C.3.1.21.4。该酶基因全长为754bp,编码254个氨基酸。限制性核酸内切酶Dpn I来源于肺炎双球菌。识别序列及裂解位点为5’...GAm/TC...3’。其主要用于生化研究,基因工程,遗传工程用工具酶。最常用于以PCR为基础的基因定点诱变实验中。在本实验中,我们首先得到了Dpn I基因,然后将其克隆到毕赤酵母分泌型表达载体pHBM905A中,重组质粒经内切酶Sal I线性化后经电转的方法转化到毕赤酵母菌株GS115中。经MD平板筛选和PCR鉴定出正确的转化子。对携带有Dpn I基因的重组GS115菌株进行摇瓶培养,经甲醇诱导后,收集上清,对其进行SDS-PAGE分析,结果显示,该蛋白获得表达,并且通过大量筛选得到高表达菌株。其摇瓶诱导第五天表达量高,但是该酶的性质分子量大小发生了变化。分子量为约为66KD,比预测蛋白分子量大,其最适反应温度为60℃,95℃酶活性还残留60%,热稳定性得到提高,最适PH值为7.6,发生这些变化的原因可能是受到糖基化的影响。糖基化试剂盒检测该蛋白质存在高度糖基化。蛋白经去糖基化处理,蛋白分子量降低到29KD,与该蛋白理论预测分子量大小相符。Dpn I在毕赤酵母中成功获得表达,该蛋白经肝素纯化后酶切实验表明DpnⅠ能特异性的切割经大肠杆菌甲基化的质粒,证明重组Dpn I蛋白具有生物活性。同时,我们将Dpn I的ORF与从来自硫磺矿硫化叶菌的Sso7d基因的ORF进行N端融合,并利用巴斯德毕赤表达系统对其进行融合蛋白表达。融合后重组蛋白获得成功表达。在进一步的工作中,我们准备利用所表达的Dpn I酶的高耐热活性,在以PCR为基础的基因定点诱变实验过程中,在PCR步骤中引入此酶,实现在PCR扩增过程中就消除模板,使得扩增产物可以直接转化,得到目的诱变产物。而不需要经过目前传统的先回收,再进行Dpn I酶切,酶切后再转化步骤。使得基因定点诱变步骤变得更佳简化,方便和省时。