【摘 要】
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猪链球菌（Streptococcus suis,S.suis）属于我国第二类动物疫病病原菌,会导致人和动物脑膜炎、败血症甚至死亡,其毒力因子与致病机制是研究的热点与难点。哺乳动物源抗菌肽Cathelicidins具有强大的抗菌和免疫调节功能,被认为是后抗生素时代的希望。Cathelicidins家族抗菌肽在多种生物体内均有报道,研究最广泛的LL-37和m CRAMP是分属于人源和鼠源的唯一Cath
【基金项目】
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国家自然科学基金面上项目（No.31873016）；
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猪链球菌（Streptococcus suis,S.suis）属于我国第二类动物疫病病原菌,会导致人和动物脑膜炎、败血症甚至死亡,其毒力因子与致病机制是研究的热点与难点。哺乳动物源抗菌肽Cathelicidins具有强大的抗菌和免疫调节功能,被认为是后抗生素时代的希望。Cathelicidins家族抗菌肽在多种生物体内均有报道,研究最广泛的LL-37和m CRAMP是分属于人源和鼠源的唯一Cathelicidin。研究发现,S.suis现已对多种常见抗生素耐药,而Cathelicidins对S.suis有良好的抗菌活性。S.suis分泌蛋白PepO属于M13蛋白酶家族,但PepO蛋白的酶学特性在其与宿主的相互作用中发挥的功能尚不清楚。本研究首次揭示了PepO蛋白酶能够酶切Cathelicidins,有助于阐明PepO参与S.suis免疫逃逸的分子机制。本研究首先通过Western bolt实验,证实S.suis的PepO为胞外分泌蛋白。应用蛋白凝胶电泳,鉴定PepO对LL-37、m CRAMP的酶切特性。结果表明,PepO蛋白酶能够以1:33的摩尔比,分别切割LL-37与m CRAMP。通过体外杀菌实验,证明LL-37对S.suis和E.coil的杀菌浓度均为为4μmol/L,m CRAMP对两者杀菌浓度均为8μmol/L,而经PepO蛋白酶切割后,2种Cathelicidins杀菌活性均丧失。通过质谱分析,确定PepO切割LL-37与m CRAMP后主要产物的蛋白序列,在此基础上化学合成LL-37的主要酶切产物——截短肽FR-7和IG-7、m CRAMP的主要酶切产物——截短肽LR-11。应用细菌活力检测试剂盒和激光共聚焦显微镜,比较LL-37与截短肽FR-7、IG-7,m CRAMP与截短肽LR-11的杀菌能力。实验发现,截短肽作用后S.suis仍有大量存活细菌,即PepO切割Cathelicidins破坏其杀菌能力。鉴于Cathelicidins具有免疫调节功能,本研究取健康人外周血中性粒细胞与小鼠骨髓源中性粒细胞,培养于Transwell细胞培养板中,使用倒置荧光显微镜测定LL-37及其截短肽FR-7、IG-7,与m CRAMP及其截短肽LR-11,对中性粒细胞的趋化效果。结果表明,LL-37对健康人中性粒细胞与小鼠中性粒细胞均有良好的趋化能力,m CRAMP对人中性粒细胞的趋化能力与LL-37相近;而截短肽FR-7、IG-7、LR-11无趋化作用。应用凋亡检测试剂盒和流式细胞仪,检测在TNF-α诱导中性粒细胞凋亡条件下不同肽的抗凋亡能力。结果发现,LL-37对健康人中性粒细胞与小鼠中性粒细胞有良好的抗凋亡能力,m CRAMP对小鼠中性粒细胞的抗凋亡能力稍弱,而截短肽FR-7、IG-7及LR-11完全丧失抗凋亡活性,表明S.suis的PepO蛋白酶通过切割宿主Cathelicidins以损害其免疫调节功能。最后,本研究以C57BL/6小鼠的菌血症模型,评价S.suis PepO蛋白酶的致病能力。结果发现,与野生株相比,Δpep O缺失株攻菌组小鼠病理损伤减轻、脏器荷菌数减少、炎性因子水平降低,说明PepO蛋白酶是S.suis重要的毒力因子。综上,S.suis PepO蛋白酶通过切割宿主Cathelicidins,破坏了Cathelicidins的抗菌和免疫调节功能,参与S.suis的免疫逃逸。本研究不仅丰富了S.suis致病机制研究,也为其它病原菌免疫逃逸研究提供了新思路。
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