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表观遗传学是指在基因的DNA序列不发生改变的情况下,基因的表达水平与功能发生改变,并产生可遗传的表型组,主要包括DNA甲基化、组蛋白修饰、染色质重塑、RNA介导的调控。组蛋白修饰是表观遗传学中很重要的调控方式。包括组蛋白的甲基化、乙酰化、磷酸化、泛素化等,它对基因的激活和抑制起着重要作用。MyoD是碱性螺旋-环-螺旋(basic helix-loop-helix, bHLH)家族的一个重要蛋白,在肌肉分化过程中起关键作用。我们以低血清诱导小鼠C2C12细胞作为肌肉分化的模型,并对其分化机制以及分化过程中早期分化标志—myogenin基因启动子区转录相关因子的结合进行研究,特别是精氨酸甲基转移酶修饰对myogenin基因表达调控机制。C2C12细胞,主要呈三角形和纺锤形,少数多边形；而低血清诱导处理后,C2C12细胞逐渐呈现典型的分化形态,如胞体伸长,出现多核肌纤维类似结构并整齐排列等。我们利用甲基转移酶抑制剂AdOx处理C2C12细胞后发现,C2C12细胞的分化受到抑制。包括细胞形态学上不能出现多核肌纤维类似结构,分化标志myogenin的蛋白水平及mRNA水平的抑制。而组蛋白修饰酶PRMT1、PCAF及CARM1的蛋白质水平在药物处理前后变化不明显。表明甲基化修饰可能是肌肉分化过程中的必需过程。双荧光素酶报告基因分析发现,在转染的各PRMT家族成员中,PRMT1和CARM1显著地增强myogenin基因启动子活性。我们进一步共转染组蛋白乙酰基转移酶PCAF、当PRMT1与CARM1及PCAF共转染时,比单独转染三者任何一个,或二二组合,激活效应更明显。说明PRMT1可与CARM1及PCAF协同激活MyoD介导的myogenin基因启动子活性。PRMT1是肌肉分化主导开关(master switch) MyoD的转录共激活子。染色质免疫沉淀(Chromatin Immunoprecipitation, ChIP)分析是近些年发展起来检测蛋白因子在体内与染色质的结合,进而为蛋白因子参与染色质水平基因转录调控提供证据的方法。本研究运用该方法,检测了低血清诱导的C2C12细胞分化过程中,肌细胞分化决定因子MyoD、乙酰转移酶PCAF与精氨酸甲基转移酶CARM1及PRMT1在myogenin基因启动子区染色质的结合情况。这些转录因子在诱导3h后即可结合到染色质。GST-pulldown实验显示,MyoD与PRMT1共存于一个复合物中。我们进一步确定了MyoD的氨基端及bHLH结构域与PRMT1相互作用,而MyoD的羧基端(MyoD162-318)则不能与PRMT1相互作用。将MyoD亚克隆至pEGFP-C1表达绿色荧光蛋白标签的融合蛋白,将PRMT1克隆至pmCherry-C1载体表达带红色荧光蛋白标签的融合蛋白。将GFP融合的MyoD与Cherry融合的PRMT1共转染C2C12细胞,48h后用激光扫描共聚焦荧光显微镜观察。我们发现,GFP-MyoD主要定位于核内,而Cherry-PRMT1则在整个细胞广泛分布,将二者荧光融合(merge)发现,绿色荧光的MyoD与红色荧光的PRMT1在细胞核内很好的融合为黄色,说明二者在细胞核内定位于相同位置。我们通过体外GST-pulldown实验以及体内免疫共沉淀(CoIP)实验证实CARM1和PCAF共存于一个复合物中,并且这种相互作用不受AdOx抑制剂的影响的。通过分子生物学手段,我们进一步找到两者的具体结合部位。其中CARM1的催化结构域及C端结构域可与PCAF相互作用,而PCAF主要是通过HAT结构域(PCAF352-658)与CARM1相互作用。利用体外甲基化反应体系及放射性自显影技术,我们首次发现PRMT家族酶的各个成员,只有PRMT1可甲基化修饰MyoD的精氨酸残基。为了确定MyoD甲基化修饰在细胞内是不是也发生,我们将带Flag标签的MyoD转染HEK 293T细胞,标记3H-甲硫氨酸(3H-Met)的同时加入蛋白质合成抑制剂。免疫亲和沉淀Flag-MyoD,放射自显影。结果显示,MyoD在细胞内存在甲基化修饰,并且AdOx可以抑制MyoD的甲基化修饰。为了确定MyoD的甲基化修饰位点,我们在细菌中表达并纯化了MyoD的N端及C端的删切突变体,加入GST-PRMT1后进行体外甲基化反应并放射性自显影,结果显示MyoD的甲基化修饰位点位于氨基酸162-318之间,即bHLH及C端结构域。为了确定MyoD甲基化修饰的精确位点,我们在体外用PRMT1甲基化修饰MyoD,ESI质谱鉴定得到带两个电荷且质荷比为910.36的MyoD片段,即RQNGYDTAYYSEAVR(氨基酸221-235),二级质谱鉴定得到上述片段的第一个精氨酸(全长MyoD的221位精氨酸)存在双甲基化修饰。综上结果,我们认为PRMT1对C2C12细胞的诱导分化过程中具有正调节作用。通过该类酶促的蛋白质精氨酸甲基化,以及其他调节因子对组蛋白的修饰或转录因子的活化,可有效地促进myogenin基因表达,并导致C2C12细胞的分化。我们首次发现PRMT1可甲基化修饰MyoD的精氨酸残基,深入研究PRMT1的调控机制有助于对肌肉细胞诱导分化机制的理解。