近年来随着水体富营养化的日益严重,有害藻类水华频繁爆发,严重破坏水生生态系统、污染水环境。铜绿微囊藻(Microcystis.aeruginosa)是形成水华的主要藻类之一,产生藻毒素,严重威胁着人类的健康。探索有效的控藻途径已经极为迫切。微生物控藻是一个高效、经济的控藻途径,已经成为目前生物控藻的研究热点,具有广泛的应用前景。其中,芽孢杆菌分布广泛,能产生多种抗菌物质,并且大多无毒,是一种理想的控藻菌属。根据文献报道及国内外研究现状,本研究从已有的多株芽孢杆菌和水华水样中筛选具有高效抑藻作用的菌株,分离其主要抑藻活性物质,并对其抑藻效应和机理进行研究。本文研究内容及结果如下:1.高效抑藻茅孢杆菌的筛选。从实验室保存的茅孢杆菌和水样中定向筛选分别得到两株抑藻活性较强的菌株B15和9-13,分别为Brevibacillus brevis和Bacillus aerophilus。2%浓度的发酵滤液对于起始浓度为106/mL的M aeruginosa均有良好的抑制作用。B15处理10天内藻细胞浓度一直低于初始浓度,抑藻率达90%以上;9-13处理的前6天藻浓度低于初始浓度水平,之后逐渐升高,10天后高于初始浓度。B15通过分泌活性物质进行抑藻,9-13的抑藻方式尚不能确定。2.B15无菌滤液的抑藻特性及抑藻效应研究。用0.3%、0.7%、1%和2%添加量的无菌滤液处理6 d后抑藻率分别为51.89%、79.89%、89.47%和86.94%。发酵48 h与发酵72 h的B15无菌滤液抑藻活性无明显差异,但略优于发酵24h。2%的无菌滤液对1.0～20 X 1 06/mL的M aeruginosa均有良好的抑藻作用,处理6天后抑藻率均达75%以上;1%的无菌滤液对1.0～10X 106/mL的M aeruginosa有抑藻作用,处理6天后抑藻率达70%以上,但对20X 106/mL的M aeruginosa抑藻作用不佳,处理6天后抑藻率仅48%。B15无菌滤液处理过程中藻细胞数目不断下降,1%添加量处理10天后抑藻率接近100%,24天后活细胞数仍在减少,抑藻效果稳定而持久。此外B15无菌滤液对多种蓝藻(如微囊藻和鱼腥藻)有良好的抑制作用,对绿藻(如斜生栅藻)有一定的抑制作用,其抑制率低于蓝藻。无菌滤液处理6 d后,藻细胞最大量子产量(Fv/Fm)、最大电子传递速率(ETRmax)均显著下降,表明其光合作用受到抑制。激光共聚焦显微镜观察发现,许多细胞停留在分裂末期,呈2细胞或4细胞状态。1%无菌滤液处理6d后藻液中2细胞和4细胞所占比例高达62.23%和14.95%,表明藻细胞分裂严重受阻。透射电镜观察结果与激光共聚焦显微镜结果一致,多数细胞呈2细胞状态,停滞在分裂末期。另外,经处理后出现质壁分离、光合片层结构及细胞膜断裂现象的藻细胞数目显著高于未处理细胞。流式细胞仪结合PI、FDA和DCFH-DA三种特异荧光和叶绿素a自发荧光探讨对M.aeruginosa的形态和生理功能的影响,结果显示PI染色1%、2%处理组中正常藻细胞所占比例分别为28.1%和22.4%,表明处理后藻细胞大量死亡且藻细胞膜完整性受到破坏;随无菌滤液添加量的增加强FDA荧光细胞所占比例不断降低,活性氧损伤细胞所占比例不断升高,2%处理组中分别占总细胞数的20.7%和35.9%,表明处理后M.aeruginosa代谢活性下降,活性氧水平升高。3.抑藻活性物质的分离纯化及性质研究。对无菌滤液超滤显示抑藻活性物质分子量小于3 kDa。将抑藻物质在4、25和37℃处理6h和24h后,抑藻活性和未处理组相比无显著差异,但50和70℃处理6h和24h后,抑藻活性和对照相比均显著下降。另外,在pH 2～12的范围内,抑藻物质都保持很好的活性。抑藻物质对胰蛋白酶和蛋白酶K均不敏感,且不能够在酸性条件下沉淀,能通过阳离子交换层析得到分离,但不能与反相C18柱结合。说明活性物质是一种非蛋白类、碱性的、亲水性小分子物质。4.藻细胞差异蛋白质组分析。通过 iTRAQ(isobaric tags for relative and absolute quantification,iTRAQ)技术和LC-MS分析处理前后藻细胞蛋白表达量的差异。用初步纯化的抑藻活性物质处理6天后,提取藻细胞总蛋白,与对照进行定量比较。通过质谱检测,总共得到1459种蛋白。69个蛋白表达量差异大于1.5倍,其中23个上调,46个下调。其中与光合作用、碳氮同化相关的蛋白表达受到显著抑制,是细胞生长繁殖受到抑制的一个主要原因。