论文部分内容阅读
恶性肿瘤已成为威胁人类健康及生命的严重疾病，目前化学治疗是恶性肿瘤治疗的重要手段之一，但其效果并不理想。肿瘤对化疗药物的抗药性是主要障碍，而未能针对不同的肿瘤类型、不同的肿瘤患者个体选择敏感的药物也是重要原因。鼻咽癌是头颈部常见恶性肿瘤，临床上以放疗和化疗为主要治疗手段。本研究以鼻咽癌HNE-1细胞株为研究对象，采用高能放射线照射HNE-1细胞，获得耐药细胞HNE-1(200)；用MTT法，检测4种临床常用抗肿瘤药物(长春新碱、平阳霉素、顺铂、5-Fu)、氧化苦参碱、表儿茶素、儿茶素及维拉帕米对两种细胞增殖抑制作用，初步得知药物对两种细胞的耐药谱及低毒浓度信息，结果发现： 1、每种药物对两种细胞有不同程度的抑制作用： 1) 长春新碱对细胞抑制率为20％以下的浓度是25ug/ml、50ug/ml；在75ug/ml、100ug/ml和125ug/ml浓度条件下，长春新碱对HNE-1(200)细胞的抑制率较HNE-1细胞明显下降，说明与HNE-1细胞经X—线照射有关，提示放射线照射可使细胞对化疗敏感性降低，诱导细胞产生耐药。重庆医科大学博d匕学位论文2)平阳霉素对细胞抑制率为20%以下的浓度是20u留ml、40u留ml;在 相同浓度条件下，平阳霉素对HNE一1(200)细胞的抑制率较HNE一1 细胞明显下降，说明放射后的HNE一1(200)细胞对平阳霉素有耐药 性。3)5一Fu对HNE一1、HNE一l(200)细胞的抑制率呈明显的浓度依赖关系， 相同浓度5一Fu对两种细胞的抑制率无明显差异。4)顺铂对HNE一1、HNE一l(2oo)细胞的抑制率没有差异，抑制率与药物 浓度成正相关。5)维拉帕米对HNE一1、HNE一1(2oo)细胞有抑制作用，但对两种细胞的 抑制作用没有差异。6)氧化苦参碱HNE一1、HNE一1(200)细胞有抑制作用，但对两种细胞的 抑制作用没有差异。7)儿茶素、表儿茶素对HNE一1、HNE一l(200)细胞几乎没有抑制作用。2、为了进一步得知HEN一1(2oo)细胞的耐药逆转药谱及逆转浓度，采用对HNE一1(200)和HNE一1细胞株无明显抑制作用剂量的维拉帕米、氧化苦参碱、儿茶素、表儿茶素分别与抗肿瘤药物联合作用于细胞，结果发现:1)低毒浓度药物间联合作用均明显增加了抗肿瘤药物对HNE一1、 HNE一1(200)细胞增殖的抑制作用，提示临床采用联合用药有可 能达到既治疗肿瘤，又减少药物的用量、减少毒副作用的目的。2)维拉帕米、氧化苦参碱、儿茶素和表儿茶素分别与抗肿瘤药物联合重庆医科大学博士学位论文 作用后，其药物增敏作用强度由高到低依次为维拉帕米、氧化苦参 碱、儿茶素和表儿茶素。3)维拉帕米、氧化苦参碱、儿茶素和表儿茶素分别与抗肿瘤药物联合 作用后，可逆转HNE一1侈oo)细胞对长春新碱和平阳霉素的耐药性。4)维拉帕米分别与长春新碱、平阳霉素联合使用对HNE一1(200)细胞的 抑制作用明显强于对HNE一1细胞的抑制作用，氧化苦参碱的药物增 敏强度与维拉帕米相似。 为了更进一步了解鼻咽癌放疗后产生多药耐药的本质，本研究采用免疫组织化学及Westem blot检测了不同条件下细胞株P一糖蛋白表达;用FCM分析细胞周期的变化，以期对其耐药机制作进一步深入了解。结果如下:1、免疫组织化学提示:1) HNE一1细胞P一gP表达为阴性，HNE一1(200)细胞P一gP表达为阳性， 说明放射线照射能诱导HNE一1细胞P一gp表达增加，从而导致 HNE一1(200)细胞对vCR和BLM产生耐药。2)维拉帕米、氧化苦参碱、表儿茶素和儿茶素与HNE一1仅oo)细胞共孵 育24小时，P一gp表达下调，维拉帕米作用最强，其它次之。2、Westem Blot检测结果显示:1) HNE一1细胞P一gP无表达，HNE一l(200)细胞P一gP表达量最高，与免 疫组化检测结果和细胞的耐药性增加相符合。2)维拉帕米、氧化苦参碱、表儿茶素和儿茶素与HNE一l(2oo)细胞共孵重庆医科大学博士学位论文 育24小时，P一gp表达下调，与它们能逆转VCR的耐药相一致。维 拉帕米对P一即表达下调作用最明显，其次是表儿茶素、儿茶素和氧 化苦参碱。3、RT一PCR结果显示:1) HNE一1、HNE一l(200)细胞的MDRmRNA表达无差异，即HNE一1细 胞经x一射线照射后，P一gP表达上调，但是MDR mRNA表达并无 增加，说明P一gp表达上调受多种机制调控。2)电泳图显示:除维拉帕米有下调MDR mRNA作用外，其余的都无 变化。4、通过对细胞周期的分析发现:1) HNE一1细胞经X一线小剂量多次照射后，G:期细胞阻滞增加2.5倍， 与文献报道相一致;2) vcR+vRp和vCR+oxy能除去G:期细胞阻滞，抑制细胞增殖。 vRP通过下调P一gP表达来增加肿瘤药物的药效，oxy也有相同作 用，推测低毒浓度下的药物联合作用提高药效与P一gP表达下调有 关;3) vCR+EC和VCR+儿茶素除去细胞Gl期阻滞，同时q期阻滞上 升，儿茶素有下调P一gP的作用，诱导细胞发生q期阻滞与文献一 致，而与对照药物维拉帕米及其氧化苦参碱不同，发生机制有待进 一步研究;4)BLM与几种药物的联合作用结果同VCR的药物联合作用结果相重庆医科大学博.士