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Y-聚谷氨酸(γ-PGA)是由L-谷氨酸和D-谷氨酸单体缩合而成的环境友好型高分子材料,具有良好的水溶性、生物降解性及生物兼容性,在食品、医药和工农业等领域具有广泛的应用前景。本研究前期发现,于纳豆芽孢杆菌发酵γ-PGA的过程中添加钙离子,可使菌体内α-酮戊二酸节点上的谷氨酸脱氢酶(GDH)酶活明显提高,使得α-酮戊二酸更多的发生氨基化反应形成谷氨酸,进而合成更多的γ-PGA。该研究以γ-PGA合成中底物谷氨酸供给调控机制为突破口,打破以往局限于对γ-PGA合成酶调控的研究策略,不仅可阐明钙调节谷氨酸脱氢酶活性的作用机制,而且为γ-PGA合成机制研究提供更广泛的理论和实验证据,也有利于为进-步提高γ-PGA合成水平提供人为控制的技术策略。期望这一生物合成的自然资源能够大量获得并发挥其在吸附材料、食品配料、医药工程等领域中的重要作用。本文主要研究结果如下：(1)以纳豆芽孢杆菌为材料,克隆获得gdhA谷氨酸脱氢酶基因,并将gdhA谷氨酸脱氢酶基因体外重组至原核表达载体pET28a(+)中,于E. coli BL21(DE3)中进行表达,成功获得了融合蛋白,将该蛋白进行SDS-PAGE蛋白质电泳,验证该蛋白及其编码基因。(2)通过体外添加钙离子的方法,测得谷氨酸脱氢酶活性在不同钙离子浓度下变化基本不大,结果表明钙离子对GDH没有体外的直接激活作用；通过在菌体培养过程中加入钙离子,利用实时定量PCR技术,测定不同钙离子浓度下gdhA基因转录水平,结果显示随着钙离子浓度的增大,gdhA基因的表达丰度也随之增大,同时酶活测定数据也验证了这一结果,这一结果充分说明了钙离子不仅可以调控谷氨酸脱氢酶在纳豆芽孢杆菌中的表达水平,同时其表达水平随钙离子浓度的增大而提高。(3)摇瓶条件下,添加不同浓度钙离子对纳豆芽孢杆菌进行发酵试验,于发酵24h后测定其菌液OD600及其γ-PGA产量。实验结果显示随着钙离子浓度的增大,菌液OD600呈现下降趋势,而γ-PGA产量呈现先增加后减小的趋势,且钙离子浓度为0.1%0时产量最高,可到达9.68g/L。结果表明γ-PGA的产量不仅与钙离子调控谷氨酸脱氢酶活性相关,还与钙离子对菌体生长的影响相关,两者的共同作用决定了细胞内γ-PGA的合成量。本研究鉴定并验证了纳豆芽孢杆菌中gdhA谷氨酸脱氢酶基因,为进一步研究钙离子在发酵聚谷氨酸过程中调控谷氨酸脱氢酶活性的机制奠定了基础。同时发现钙离子对谷氨酸脱氢酶活性的调控属于体内调节作用,且其对菌体生长及最终聚谷氨酸产量均起到决定性作用,这些详实的实验证据有利于为进一步提高γ-PGA合成水平提供人为控制的技术策略。