目的：肾间质纤维化是决定慢性肾脏病(Chronic kidney disease,CKD)的发生发展及预后的重要因素,早期防治甚至逆转肾间质纤维化对防治CKD的发展具有重要的意义。诊断肾脏疾病的金标准为肾穿刺病理活检,但它需要取出一小部分肾组织来进行病理检验,是一项侵入性的操作,存在3%的主要并发症如出血、组织损伤等风险,所以寻找可靠、无创伤的生物标志物具有重要的意义。MicroRNAs(miRNAs)在肾脏疾病诊断及判断疾病的进展中具有重要作用,miRNAs在组织和体液中都非常的稳定,收集尿液的操作简易可行,所以识别尿液miRNAs水平可作为一种的判断疾病的具有潜在的吸引力的生物标志物。miR-21是肾脏纤维化的关键环节,持续地过表达miR-21扰乱了组织的修复并且导致组织纤维化,研究报道在肾脏纤维化的经典动物模型单侧输尿管梗阻(UUO)中,miR-21的表达水平增强,抑制miR-21的表达后大鼠模型的肾脏纤维化程度明显改善。抑制miR-21是改善组织纤维化的一条新途径。近年来现代化的中医药研究迫切需要具有中医证候特点或“病证结合”的生物标志物和动物模型,以便使中医药科研工作更加科学化、客观化,这是目前中西医学者研究的热点与难点。文献报道,气虚血瘀证为肾间质纤维化患者的最常见的中医证候,本临床研究拟用定量聚合酶链反应法(RT-qPCR)测定肾间质纤维化气虚血瘀证患者肾活检当日尿沉渣中的miR-21mRNA的表达,并且探讨其与肾间质纤维化程度、气虚血瘀证积分等指标之间的相关性。既往研究提示三芪口服液(广东省中医院院内制剂,由黄芪、三七等组成)可有效防治单侧输尿管梗阻(UUO)大鼠模型的肾间质纤维化,但具体作用机制有待深入研究。本研究我们通过单侧输尿管梗阻模型(UUO)加大鼠疲劳力竭游泳的方法建立病证结合的模型(肾间质纤维化加气虚血瘀证模型),检测三芪口服液干预后肾组织miR-21mRNA以及基因芯片检测差异基因的表达,进一步RT-qPCR法验证,以期阐释三芪口服液防治UUO模型气虚血瘀证大鼠肾间质纤维化的作用机制。综上所述,本研究针对肾间质纤维化的miR-21mRNA表达进行了探讨,临床部分旨在检测肾间质纤维化气虚血瘀证患者尿沉渣miR-21mRNA表达及探讨与纤维化程度等之间的相关性,以期探索出无创的生物标志物为本病提供预测依据；实验部分旨在构建肾间质纤维化加气虚血瘀证模型基础上,检测三芪口服液干预后肾组织miR-21mRNA以及基因芯片检测差异基因的表达,以期阐释三芪口服液防治UUO模型气虚血瘀证大鼠肾间质纤维化的作用机制。方法：1临床研究1.1病例选择选择符合本研究纳入标准(符合慢性肾脏病诊断标准及气虚血瘀证的辨证标准等)及除外排除标准的患者共30例。1.2研究分组入院行肾活检术后,根据肾脏病理提示有无存在肾间质纤维化而分为纤维化组和无纤维化组两组。纤维化组即肾脏病理提示存在肾间质纤维化的患者共20例,无肾间质纤维化的患者共10例；另选择健康对照组共10例。1.3检测指标及研究内容检测两组患者肾活检前24h尿蛋白定量、血红蛋白、血清白蛋白、血清肌酐,计算肾小球滤过率(eGFR)及计算气虚血瘀证的积分；留取患者肾活检当日及健康组的晨尿,应用定量聚合酶链反应法(RT-qPCR)检测各组尿沉渣miR-21mRNA的表达,比较各组间尿沉渣miR-21mRNA的表达差异,并探讨其与肾间质纤维化、气虚血瘀证等指标之间的相关性。2实验研究2.1研究分组24只SD大鼠随机分为三组：空白组、纤维化气虚血瘀证模型组(以下简称模型组)、纤维化气虚血瘀证+三芪口服液组(以下简称三芪组),每组均8只。2.2造模方法2.2.1UUO模型复制方法UUO模型复制采用左侧输尿管结扎术,术前器械消毒,大鼠称重后用10%水合氯醛0.3-0.4ml/100g腹腔内注射麻醉,将大鼠俯卧位固定于鼠板,备皮,常规消毒,戴无菌手套,铺无菌孔巾,在大鼠背部,左侧肋腰点下约0.5cm、脊柱左侧约1cm作一纵向切口,1.5-2cm长,逐层分离皮下组织、肌肉,充分暴露肾脏,用小弯镊轻轻剥离肾下极部分包膜及肾蒂处包膜,分离出输尿管,用“1”号丝线分别在紧靠肾盂处及远离肾孟约lcm处结扎输尿管,在两结点中间离断输尿管,用庆大霉素生理盐水冲洗腹腔后,检查无渗漏和出血后逐层缝合肌肉及背部常规消毒。2.2.2气虚血瘀证模型复制方法采用大鼠疲劳力竭游泳的方法复制气虚血瘀证中医证候模型,模型复制时间为28天。游泳条件为：(1)室温：24-25℃；(2)游泳水温：22～24℃；(3)游泳场地：为直径50cm,高度60cm的圆形水槽,水深控制为45-50cm；(4)力竭标准：以大鼠冗入水中10s不能自行浮出水面为力竭,即将大鼠捞出。当全组50%自然沉降时停止2.2.3纤维化气虚血瘀证模型复制的方法根据文献报导及前期实验研究结果,采用UUO模型加大鼠疲劳力竭游泳实验的方去复制：在UUO模型复制10天,大鼠伤口完全愈合后开始疲劳力竭游泳,连续28天进行模型复制。2.3干预措施三芪组的干预开始时间与气虚血瘀证模型复制时间同步,上午进行模型复制,下午进行给药干预。三芪口服液组按照成人每日药剂量核算大鼠的每日药剂量,每日大鼠的给药剂量为1.2m1/100g大鼠,其余各组予以等体积蒸馏水灌胃,连续给药28天。2.4检测指标2.4.1检测各组大鼠肾组织HE、Masson染色及AFS、CIS的病理积分、气虚血瘀证积分的变化。2.4.2基因芯片检测：具体步骤为,肾组织总RNA的进一步纯化、鉴定及标记；RNA的鉴定；采用安捷伦大鼠全基因表达谱芯片(每个芯片含41000个基因探针),每份标记的RNA标本分别单独与一个基因芯片进行杂交(每个时间点实验组、对照组各5个标本)。统计学分析方法：扫描结果使用数据处理软件安捷伦芯片数据提取软件10.5.1.1进行处理；差异基因分析与信号通路分析则是将实验组与对照组进行两独立样本t检验,以P<0.05、基因表达上调或下调的倍数≥2为标准,差异有显著性的即为与纤维化信号通路相关的基因。信号通路分析以Fisher’s精确性检验,P<0.05为差异有统计学意义。2.4.3定量聚合酶链反应法(RT-qPCR)检测各组miR-21mRNA及差异基因以及的表达,探索三芪口服液防治肾间质纤维化气虚血瘀证模型大鼠的作用机制。结果：1临床研究1.1纳入研究者一般情况符合纳入及排除标准的慢性肾脏病患者30例,其中男性16例,女性14例。另选取健康组10例,其中男性6人,女性4人。慢性肾脏病组同健康组在性别、年龄方面比较,差异无统计学意义；1.2患者原发病构成入院后肾穿刺病理活检提示,IgA肾病患者24例,局灶增生肾小球硬化3例,慢性间质性肾炎3例；其中存在肾间质纤维化的患者20例,无肾间质纤维化患者10例。将肾脏活检病理提示存在肾间质纤维化的20例患者纳入纤维化组,无肾间质纤维化患者的10例纳入无纤维化组；1.3生化指标、气虚血瘀证积分及肾间质纤维化程度纤维化组和无纤维化组比较,气虚血瘀证积分明显升高,差异有统计学意义(P<0.05),两组在年龄、血红蛋白、血白蛋白、24h尿蛋白定量、血清肌酐、eGFR等方面比较,差异均无统计学意义；1.4尿沉渣miR-21mRNA表达水平纤维化组分别与无纤维化组患者及健康组比较,尿miR-21mRNA表达水平均明显升高,差异有统计学意义(分别为P<0.05,P<0.01)；无纤维化组患者与健康组比较,差异无统计学意义；1.5相关性研究肾间质纤维化程度与尿沉渣miR-21mRNA水平、气虚血瘀证积分均呈正相关关系(相关系数分别为r=0.573,p=0.001；r=0.531,p=0.003)；与eGFR呈负相关关系(相关系数分别为r=-0.620,p=0.000)；尿沉渣miR-21mRNA水平与肾间质纤维化程度、气虚血瘀证积分均呈正相关关系(相关系数分别为r=0.573,p=0.001；r=0.619,p=0.000)。2实验研究2.1一般情况实验过程中,模型组及三芪组各老鼠死亡1只,原因为游泳疲劳实验过程中溺死,空白对照组大鼠体重增长明显,精神状况良好,动作自如,反应灵敏,毛皮有光泽；模型组大鼠明显消瘦,饮水较多,小便多,大便溏,精神萎靡,反映迟钝,毛竖无光泽,动作迟缓。三芪组大鼠精神状况较差,动作稍迟缓,体形较模型组组增长,大便成形,小便较多,对外界反映灵敏度较正常组差优于模型组。2.2气虚、血瘀证积分模型组大鼠气虚证、血瘀证积分均明显升高,与空白组比较,差异有统计学意义(分别为P<0.05,P<0.01),提示模型组成功构建了气虚血瘀证的模型。三芪组大鼠气虚证、血瘀证积分均明显减少,与模型组比较,差异有统计学意义(P<0.05),而与空白组比较,差异无统计学意义。结果提示益气活血功效的三芪口服液可以明显改善模型大鼠的气虚血瘀证。2.3HE及Masson染色、肾小管间质细胞浸润评分(CIS)及肾间质慢性病变积分(AFS)HE、Masson染色可见,模型组、三芪组出现明显肾小管间质纤维化,CIS、AFS评分明显增高,与空白组比较,差异有统计学意义(P<0.001),提示肾间质纤维化模型构建成功；三芪组与模型组比较,模型大鼠的肾间质纤维化明显改善,CIS、AFS评分明显减少,差异有统计学意义(P<0.05)。2.4基因芯片结果2.4.1信号通路分析模型组与空白组比较,共42个信号通路出现上调,并且差异有统计学意义(P<0.05),其中与纤维化相关的MAPK信号通路的Fisher-Pvalue为0.0058；三芪组与模型组比较,共30个信号通路出现下调,并且差异有统计学意义(P<0.05),其中MAPK信号通路的P值为0.013。2.4.2差异基因分析模型组与空白组比较,MAPK信号通路中p38/MAPK多个基因上调,差异有统计学意义(P<0.05),尤其是促炎症因子,如TNF、IL-1、FASL、TGF-β的表达上调；三芪组与模型组比较,MAPK信号通路中ERK/MAPK以及p38/MAPK中多个基因出现下调,差异有统计学意义(P<0.05),尤其是促炎症因子,如TNF、IL-1、FASL等的表达下调。2.5RT-qPCR检测miR-21、TNF-α］IL-1、Smad7、α-SMA mRNA文献报道miR-21、Smad7是改善肾纤维化的新途径。α-SMA是活化的成纤维细胞的标志性蛋白。基因芯片结果提示模型组多个促炎症因子(TNF、IL-1)过表达,三芪口服液可以明显下调以上因子的表达,所以本研究通过检测miR-21、Smad7、TNF-α、IL-1及α-SMAmRNA表达,探索三芪口服液防治肾间质纤维化的进一步机制。结果提示,模型组miR-21、IL-1、α-SMA mRNA表达均明显上调,与空白组比较,差异有统计学意义(分别是P<0.01,P<0.05)；与模型组比较,三芪组miR-21、IL-1、 α-SMA mRNA的表达均明显下调,差异有统计学意义(P<0.05)；三芪组Smad7mRNA表达明显升高,与空白组比较,差异有统计学意义(P<0.05)；但模型组与空白组比较,差异无统计学意义；三组TNF-α mRNA的表达差异均无统计学意义。结论：1临床研究1.1肾间质纤维化气虚血瘀证患者尿沉渣miR-21mRNA的表达水平明显高于健康组及无纤维化组,差异有统计学意义(分别为P<0.05,P<0.01)；无肾间质纤维化的患者与健康组比较,差异无统计学意义。1.2尿沉渣miR-21mRNA水平与肾间质纤维化程度、气虚血瘀证积分均呈正相关关系(相关系数分别为r=0.573, p=0.001; r=0.619, p=0.000)。以上结果提示,尿沉渣miR-21mRNA可能为肾间质纤维化气虚血瘀证患者的特异性指标之一,在今后的工作中值得进一步扩大样本进行深入研究。2实验研究2.1单侧输尿管梗阻模型(UUO)加疲劳力竭游泳实验造模,病理结果提示模型组肾小管间质纤维化明显,气虚血瘀证积分明显升高,肾组织miR-21mRNA表达明显上调,提示成功地复制出“肾间质纤维化+气虚血瘀证”的“病证结合”的动物模型。2.2三芪口服液能有效改善UUO气虚血瘀证大鼠的肾间质纤维化,其机制可能是通过下调miR-21、IL-1、α-SMAmRNA的表达,上调Smad7mRNA的水平,改善炎症状态、减少成纤维化细胞的增殖,从而改善肾间质纤维化。综上所述,本研究从临床及实验研究两部分针对肾间质纤维化的miR-21表达进行了研究,为肾间质纤维化气虚血瘀证患者提供了可靠、无创伤的临床预测因子,以及阐释了三芪口服液有效防治肾间质纤维化气虚血瘀证的机制,为进一步新药开发奠定了基础。