【摘 要】
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α-淀粉酶是重要的工业用酶,被普遍应用于食品、制糖、洗涤剂、纺织、造纸、医药等不同的产业中。其中有的行业需要能在低温下表现出高催化效率的α-淀粉酶,也有的行业需要在
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α-淀粉酶是重要的工业用酶,被普遍应用于食品、制糖、洗涤剂、纺织、造纸、医药等不同的产业中。其中有的行业需要能在低温下表现出高催化效率的α-淀粉酶,也有的行业需要在高温下热稳定性好的α-淀粉酶。因此对嗜冷淀粉酶的嗜冷机理研究、以及嗜温淀粉酶的热稳定性改良研究都显得尤为重要。本论文工作主要分两部分:一是从嗜热子囊菌(Thermoascus crustaceus)JCM12803中克隆得到一低温α-淀粉酶的编码基因Tcamy,并成功在毕赤酵母里实现异源表达,其编码的蛋白Tcamy的最适温度为35℃,在0°C下保持有27%的活性,35℃下的比活为262.56 U/mg,以及较好的pH稳定性,这些特性决定了Tcamy有着较好的应用前景;通过同源建模,从N-糖基化、氨基酸组成和分子内部相互作用力三个方面分析了其冷适应性的分子机制,加深了人们对低温α-淀粉酶在结构与功能相互关系上的认识。二是以来自于嗜热篮状菌(Talaromyces leycettanus)JCM12802的α-淀粉酶基因Amy13A的基础上替换一个Linker后构建的突变体工程基因Amy13A21为材料,并基于蛋白表面电荷分布优化的理性设计对Amy13A21进行热稳定性改良,通过酶热稳定性系统(ETSS)的计算结果,确定了可能与热稳定性有关的两个位点Glu87和Tyr280。构建了单点突变E87K、Y280K和组合突变E87K/Y280K并成功进行异源表达和完成酶性质的测定,并与野生型Amy13A21进行了比较。三个突变体的热稳定性都较野生型有所提高,提高幅度为E87K/Y280K>Y280K>E87K。组合突变体E87K/Y280K较野生型Amy13A21的T50和Tm值分别提高了8℃和6.75℃。其催化活力从野生型的80.97 U/mg提高到了161.175U/mg。本论文一是为工业上提供了一个具有潜力的真菌来源的低温α-淀粉酶Tcamy,并以其为研究模型,探讨了其冷适应性机制,一方面可帮助加深我们对低温酶的认识,另一方面可为后续工作中,为基于应用需求为指导的酶分子改良研究提供科学依据。二是以本实验室已构建成功的工程基因Amy13A21为研究对象,基于蛋白表面电荷分布优化的理性设计,在酶活无损失的前提下有效提高了Amy13A21的热稳定性,为酶热稳定性改造提供了一条有效的策略。
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