论文部分内容阅读
第一部分C57BL/6J-EGFP转基因小鼠脐带间充质干细胞分离、培养及其荧光标记的鉴定目的建立小鼠脐带间充质干细胞（UMSCs）的分离与体外培养、扩增的方法；证明从C57BL/6J-EGFP转基因小鼠脐带分离得到的UMSCs在体外可以稳定表达增强型绿色荧光蛋白（EGFP），从而为移植细胞的体内示踪提供有利工具。方法取孕16天C57BL/6J-EGFP转基因小鼠，采用胶原酶和胰酶两步法分离出单个UMSCs，贴壁法进行培养、纯化；观察细胞形态特征及生长状态；流式细胞仪测定其表面标志；进行成脂、成骨诱导及鉴定；在荧光显微镜下观察不同代细胞EGFP的表达，收集不同代的细胞鉴定EGFP基因及蛋白的表达。结果1.胶原酶和胰酶两步法消化脐带可获得大量单个细胞，在体外可以稳定的生长、扩增。2.倒置显微镜下观察细胞呈长梭形，束状密集平行或旋涡状排列。3.流式细胞仪检测结果显示，分离得到的细胞稳定表达相关抗原标记CD90和CD106，但不表达CD34和CD45。4.在体外诱导下，分离得到的细胞可向脂肪细胞、成骨细胞分化。5.荧光显微镜下可观察到细胞内强烈的绿色荧光表达。6.EGFP基因PCR结果表明各代细胞均稳定表达EGFP基因；免疫细胞化学法显示细胞胞浆内EGFP的表达。结论成功的建立了小鼠脐带间充质干细胞（UMSCs）的分离与体外培养、扩增的方法；证明了从C57BL/6J-EGFP转基因小鼠脐带分离得到的UMSCs各代能稳定表达增强型绿色荧光蛋白（EGFP）。第二部分脐带间充质干细胞移植治疗急性肝衰竭小鼠的疗效观察及移植细胞的体内示踪目的用D-氨基半乳糖联合脂多糖建立小鼠急性肝衰竭模型；评价脐带间充质干细胞（UMSCs）移植治疗急性肝衰竭的疗效；观察在体示踪增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因标记的UMSCs的可行性，以及标记干细胞在模型动物体内的动态分布。方法用D-氨基半乳糖联合脂多糖腹腔注射的方法建立小鼠急性肝衰竭模型。建模6h后将模型随机分为：UMSCs移植组、生理盐水对照组，比较两组小鼠治疗前后一般情况，不同时间点肝功能恢复情况，肝脏病理改变情况结果。取不同时间点UMSCs移植组小鼠肺、肝组织做冰冻切片，荧光显微镜下观察EGFP荧光标记细胞在肺、肝组织的迁移和分布规律。取不同时间点UMSCs移植组小鼠的肝脏组织，利用相对定量RT-PCR对绿色荧光蛋白基因进行检测，从而对UMSCs量的变化进行分析。结果UMSCs移植组小鼠存活率（40%）显著高于生理盐水对照组（10%），肝脏功能及肝脏病理均有部分改善。移植后24h，肝脏损伤区未见标记细胞，移植后3d，标记的UMSCs开始迁移、聚集在损伤肝脏。相对定量RT-PCR显示EGFP基因在肝脏内3d时表达量是24h时的1.66倍，在1月时表达量是24h时的5.17倍。结论移植同种异体UMSCs对于急性肝衰竭小鼠具有明显的治疗作用。经尾静脉移植的EGFP荧光标记的UMSCs能够向受损的肝脏迁移并定植。