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第一部分急性肺损伤大鼠PAI-1与相关因子的表达及其意义背景:急性肺损伤（ALI）和急性呼吸窘迫综合征（ARDS）是心源性以外的各种肺内外致病因素导致的急性进行性缺氧性呼吸衰竭,病死率高。研究表明炎症是ALI发病的中心环节,炎症和肺组织重塑及胶原的沉积是同时进行的。纤溶酶原激活物抑制剂-1（PAI-1）是纤溶酶原激活剂主要的抑制物,其基因表达水平与肺中胶原沉积密切相关。PAI-1还通过作用于基质金属酶、肝细胞生长因子、细胞迁移等影响肺损伤修复。目的:探索急性肺损伤大鼠PAI-1表达的变化规律,以便寻找合适的干预手段和时机;初步探讨PAI-1相关因子的表达情况及其在急性肺损伤中的意义。方法:4～5周清洁级SD雄性大鼠（180～200g）随机分7组:生理盐水组作为基线（B-A）,内毒素（LPS）组分别于造模2h、4h、8h、16h、24h、48h处死,即为LPS-A 2h、LPS-A 4h、LPS-A 8h、LPS-A 16h、LPS-A 24h、LPS-A 48h组,每组大鼠8～10只。采用腹腔注射LPS 0.1mg/kg 16h后气管滴入LPS 1mg/kg的二次打击方法诱导大鼠急性肺损伤模型,生理盐水组相应予等量生理盐水处理。测定各时点的血气分析、肺组织病理评分、支气管肺泡灌洗液（BALF）白细胞（WBC）计数和总蛋白（TP）、肺组织匀浆髓过氧化物酶（MPO）活性和丙二醛（MDA）含量、肺湿干重比（B-A、LPS-A 4h、LPS-A 24h组另取6只）。酶联免疫吸附试验（ELISA）测定血浆和BALF中PAI-1水平,实时荧光定量PCR测定肺组织PAI-1及尿激酶型纤溶酶原激活剂（uPA）、基质金属蛋白酶-9（MMP-9）、肝细胞生长因子（HGF）mRNA表达水平,免疫组化法测定肺组织PAI-1及uPA、MMP-9、HGF蛋白表达水平,改良的MSB染色法进行肺纤维素染色。结果:1.急性肺损伤模型的建立:LPS二次打击2h后动脉血氧分压（PaO2）下降,4h、8h达谷底,直至48h均低于基线水平。肺部病理显示二次打击2h即出现急性肺损伤表现,4h病变加重弥漫,高峰持续至24～48h,表现有炎性细胞浸润、肺泡内和间质出血,肺水肿、肺实变不张等。BALF WBC计数和肺组织MPO活性,BALF TP均在2h上升高于基线水平,渐达高峰持续至24～48h,与病理评分变化一致。肺组织MDA含量在4h上升,渐达高峰持续至24～48h（P＜0.05）。肺湿干重比4h有上升趋势,24h有进一步加重的趋势,统计学上无显著差异（P＞0.05）。2.肺组织PAI-1的表达情况:LPS二次打击后2h血浆PAI-1浓度有上升趋势,8h～16h高于基线水平;而BALF PAI-1水平和肺组织PAI-1蛋白表达水平在二次打击2h直至48h均高于基线水平（P＜0.05）,并有进行性加重的趋势;PAI-1mRNA表达在二次打击2h时开始增高,高峰持续于2～16h（P＜0.05）,48h恢复至基线水平。血浆与BALF PAI-1浓度、肺组织PAI-1 mRNA和蛋白表达水平均相互呈正相关,其中血浆、BALF PAI-1水平、肺组织PAI-1蛋白的表达与肺病理评分呈正相关（P＜0.05）。3.肺组织PAI-1相关因子的表达情况:①LPS二次打击后uPA mRNA表达水平很快增高,2h达高峰（P＜0.05）,但4h即降至基线水平;uPA蛋白表达水平有2h上升、4h下降的趋势（P＞0.05）,8h后uPA蛋白表达水平均低于2h,24h时最低,低于基线水平（P＜0.05）。②PAI-1/uPAmRNA在LPS二次打击2h时较基线水平增高,8h～16h达高峰,直至48h仍高于基线水平（P＜0.05）,肺组织PAI-1/uPA蛋白比值在LPS二次打击后4h时后高于基线水平,8h及之后各时点高于4h（P＜0.05）。纤维素染色显示肺纤维蛋白沉积的变化趋势与肺组织PAI-1蛋白和PAI-1/uPA蛋白比值的变化趋势基本一致。PAI-1 mRNA/uPA mRNA和PAI-1/uPA蛋白比值与肺病理评分呈正相关（P＜0.01）。③MMP-9 mRNA在LPS二次打击2h有升高趋势,之后维持在较高水平,48h有下降趋势（P＞0.05）;LPS二次打击后4h时MMP-9蛋白表达水平较基线水平增高,持续至24h（P＜0.05）,48h降至基线水平。④HGF mRNA在LPS二次打击后2h、4h有进行性上升趋势,8h时较基线水平增高（P＜0.05）,24h下降至基线水平;LPS二次打击后4h时HGF蛋白较基线水平增高,持续至24h（P＜0.05）,48h降至基线水平（P＞0.05）。结论:1.PAI-1在内毒素诱导的大鼠急性肺损伤早期即表达增高,且持续时间相对长,与uPA之间比例失调导致纤溶失衡;PAI-1高表达和纤溶失衡与急性肺损伤发生发展及异常修复密切相关;BALF PAI-1浓度能较好地反映肺组织PAI-1蛋白的表达,预示急性肺损伤的严重性。2.MMP-9和HGF在急性肺损伤中表达先增高后降低,下降时间早于PAI-1,可能影响急性肺损伤的细胞外基质清除和肺修复过程。第二部分一氧化氮和高氧吸入对大鼠急性肺损伤PAI-1表达的影响及其作用背景:急性肺损伤时由炎症促发的凝血纤溶功能紊乱是肺泡和肺微血管纤维蛋白沉积的主要原因。纤溶和凝血紊乱影响ALI/ARDS的发生发展和预后,成为治疗ALI/ARDS的新目标。PAI-1增高与ALI/ARDS肺局部纤维蛋白沉积密切相关,因此抑制PAI-1基因的表达可作为急性肺损伤的新的干预点。吸入一氧化氮（iNO）在临床上作为严重ARDS的急救手段,往往在ARDS的晚期机械通气等方法难以控制时使用。有研究表明早期iNO可以预防内毒素引起的血管内皮细胞功能失调。也有资料显示一氧化氮（NO）可抑制PAI-1的表达。我们将采用早期iNO,探讨治疗剂量NO干预对急性肺损伤PAI-1表达的影响。严重ARDS的病人往往高浓度氧疗。研究表明长时间高氧暴露的小鼠过度表达PAI-1。有动物实验提示iNO可降低长期高氧暴露下新生大鼠的病死率。iNO对高氧治疗下急性肺损伤的PAI-1表达的影响尚不明了。体内内皮细胞、上皮细胞、血小板、中性粒细胞、巨噬细胞、神经组织在一定刺激下由NOS合成酶（NOS）合成NO。外源性的NO势必对内源性NO系统产生影响,这种影响对急性肺损伤PAI-1的表达的意义值得进一步探讨。目的:探讨吸入一氧化氮和高氧对内毒素（LPS）二次打击诱导大鼠急性肺损伤PAI-1表达的影响及其意义;初步探讨吸入一氧化氮和高氧对急性肺损伤大鼠PAI-1相关因子表达的影响;探讨吸入一氧化氮和高氧后急性肺损伤大鼠内源性NO系统的变化及其与PAI-1表达的关系。方法:4～5周清洁级SD雄性大鼠（180～200g）随机分为生理盐水对照组简称C,内毒素造模组简称LPS。采用腹腔注射LPS 0.1mg/kg 16h后气管滴入LPS 1mg/kg的二次打击方法诱导大鼠急性肺损伤模型,生理盐水组相应予等量生理盐水处理。造模后C组和LPS组分别随机给予吸入空气（A）、20ppmNO（NO）、95%氧气（O）、20ppmNO加95%氧气（ONO）4种气体,不同气体干预4h、24h及干预24h观察至造模48h。C组每个时点6～8只大鼠,LPS组每个时点8～10只。实时荧光定量PCR测定肺组织PAI-1及uPA、MMP-9、HGF mRNA表达水平,免疫组化法测定肺组织PAI-1及uPA、MMP-9、HGF蛋白表达水平;改良MSB染色法进行肺纤维素染色,HE染色肺病理评分;测定肺组织总一氧化氮合酶（tNOS）、构成型一氧化氮合酶（cNOS）和诱导型一氧化氮合酶（iNOS）活性以及NO含量。结果:1.一氧化氮吸入与高氧对急性肺损伤PAI-1及相关因子表达的影响:①肺组织PAI-1 mRNA表达在造模4h、24h时,LPS-A组和LPS-O组较相应C组增高,iNO干预的LPS-NO组和LPS-ONO组较LPS-A和LPS-O组降低;造模48h时,LPS-A组表达降至正常对照水平,而高氧干预的LPS-O组表达仍持续增高,高于C-O组,iNO干预的LPS-ONO组较LPS-O组降低（P＜0.05）。肺组织PAI-1蛋白在造模4h时,iNO干预的LPS-NO组表达低,与对照组无显著差异,并低于其他气体干预的LPS组（P＜0.05）;造模24h时,所有LPS组较相应C组表达增高（P＜0.05）,iNO干预的LPS-NO组和LPS-ONO组较LPS-A组和LPS-O组有下降趋势（P＞0.05）;造模48h时,iNO干预的LPS-NO组和LPS-ONO组降至正常对照水平（P＞0.05）,LPS-NO组较其他气体干预的LPS组降低,LPS-ONO组较LPS-O组降低（P＜0.05）。②肺组织uPA mRNA表达在造模4h、24h、48h各时点,所有LPS组与相应C组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。肺组织uPA蛋白表达在造模24h时LPS-A组和LPS-O组分别低于相应C组（P＜0.05）;LPS-NO组和LPS-ONO组较LPS-A组和LPS-O组升高（P＜0.05）。③肺组织PAI-1 mRNA/uPA mRNA在造模4h时,所有LPS组大鼠较相应C组增高;造模24h、48h时,仅LPS-A组和LPS-O组高于相应C组（P＜0.05）,iNO干预的LPS-NO组和LPS-ONO组已降至正常对照水平,其中造模48h时LPS-NO组和LPS-ONO组较LPS-A组和LPS-O组降低（P＜0.05）。肺组织PAI-1/uPA蛋白比值在造模4h时,iNO干预的LPS-NO组比值低,与对照组比较无显著差异（P＞0.05）,其他气体干预的LPS组则高于相应C组（P＜0.05）,LPS-NO组较LPS-A组,LPS-ONO组较LPS-O组有降低趋势,但差异无统计学意义（P＞0.05）;造模24h时,所有LPS组均高于相应C组（P＜0.05）,造模48h时,只有LPS-NO组降至正常对照水平;在造模24h和48h时iNO干预的LPS-NO组和LPS-ONO组较LPS-A组和LPS-O组降低（P＜0.05）。④肺组织MMP-9mRNA在造模24h时,所有LPS组高于相应C组（P＜0.05）;不同气体干预的LPS组肺组织PAI-1mRNA表达差异无统计学意义（P＞0.05）。肺组织MMP-9蛋白在造模4h和24h时,所有LPS组较相应C组有增高趋势;造模48h时,LPS-O组高于C-O组（P＜0.05）,其他LPS组均在正常对照水平。⑤肺组织HGFmRNA表达在造模4h和24h时,所有LPS组较相应C组有增高趋势（P＞0.05）,其中LPS-NO组高于C-NO组（P＜0.05）;造模48h时,所有LPS组HGF mRNA表达下降至正常对照水平。肺组织HGF蛋白表达在造模4h和24h时,所有LPS组较相应C组增高（P＜0.05）,造模48h时,LPS组大鼠HGF蛋白表达均降至正常对照水平。2.iNO与高氧对急性肺损伤内源性NO系统的影响及与PAI-1表达的关系:①肺组织iNOS活性在造模4h、24h和48h,所有LPS组较相应C组均有增高趋势,其中在4h、24h时LPS-A组和LPS-O组以及48h时LPS-A组较相应C组增高,差异有统计学意义（P＜0.05）;一氧化氮干预后iNOS活性有下降趋势,在造模24h时LPS-NO和LPS-ONO组低于LPS-A组（P＜0.05）。②肺组织cNOS活性在造模4h和24h时,LPS-A组和LPS-O组大鼠较相应C组有下降趋势;其中造模24h时,LPS-A组较C-A组下降,差异有统计学意义（P＜0.05）,LPS-A组较其他气体干预下的LPS组肺组织cNOS活性降低（P＜0.05）;造模48h时,LPS-NO组肺组织cNOS活性高于LPS-A组（P＜0.05）。③肺组织tNOS活性在造模4h时LPS组与相应C组大鼠比较差异无统计学意义;在造模24h和48h时LPS组肺组织tNOS活性较相应C组有增高趋势（P＞0.05）。④肺组织NO含量以NO2-和NO3-之和表示。NO含量在造模4h、48h时所有LPS组高于相应C组（P＜0.05）;在造模24h时LPS-NO组NO含量下降至正常对照水平,并较其LPS-A组下降（P＜0.05）。其他气体干预的LPS组仍高于相应C组（P＜0.05）。⑤在造模4h、24h、48h时,iNOS活性与PAI-1 mRNA和蛋白表达均呈正相关（P＜0.05）,而cNOS活性与PAI-1 mRNA和蛋白表达均呈负相关（P＜0.05）。在各时点,肺组织NO含量与PAI-1 mRNA和蛋白表达均呈正相关（P＜0.05）。3.一氧化氮吸入与高氧对肺组织病理学的影响:肺病理评分在造模4h、24h、48h各时点,所有LPS组均大于相应C组（P＜0.05）。LPS-NO组、LPS-ONO较LPS-A和LPS-O组肺病理评分有下降趋势（P＞0.05）,其中24h时,LPS-NO组较LPS-A组下降差异有统计学意义（P＜0.05）。肺组织纤维素染色C组肺组织未见明显纤维蛋白沉着,LPS组可见肺泡腔,小血管腔及间质有纤维蛋白沉积,LPS-NO组和LPS-ONO组较LPS-A组和LPS-O组有所减轻。结论:1.早期20ppmNO吸入可抑制内毒素所致大鼠急性肺损伤PAI-1的高表达,纠正高氧暴露后PAI-1高表达延长,缓解纤溶失衡,减轻肺损伤,同时也为临床急性肺损伤早期iNO干预治疗提供实验依据。2.iNO降低急性肺损伤肺组织iNOS活性和NO产量,这种作用与PAI-1mRNA和蛋白表达下调密切相关。