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目的:通过抑制骨髓间充质干细胞(MSCs)旁分泌转化生长因子-β1(TGF-β1)对多柔比星(DOX)受损心肌细胞的作用,观察心肌细胞凋亡水平的改变,并探索其可能机制,为进一步提高MSCs移植治疗的有效性提供理论依据。
方法:(1)用酶消化法和差速贴壁法分离、纯化新生SD大鼠心肌细胞。用全骨髓贴壁法分离培养SD大鼠MSCs。(2)用不同浓度DOX(0.5、1、2μmol/L)处理培养第3天的心肌细胞,对各浓度组的不同时间点(4、12、24、48h)进行检测,建立DOX心肌细胞损伤的体外模型。(3)将培养第3天的心肌细胞随机分为三组:A组,正常对照组;B组,DOX损伤组;C组,TGF-β1干预组。同时建立MSCs与心肌细胞共培养体系,并分为三组:D组,DOX损伤组;E组,DOX损伤+4MSCs共培养组;F组,DOX损伤+MSCs+LY364947(TGF-β1受体特异性抑制剂)共培养组。(4)α-横纹肌肌动蛋白(α-SA)免疫细胞化学染色法鉴定心肌细胞纯度,流式细胞仪检测培养第三代的MSCs的表面标志CD90和CD45。MTT法检测心肌细胞存活率,流式细胞术AnnexinV/PI双染法检测各组心肌细胞凋亡率,ELISA法检测心肌细胞和MSCs上清中TGF-β1的浓度,Westernblot法检测各组心肌细胞Caspase-9的蛋白表达。
结果:(1)用酶消化法和差速贴壁法可分离获得状态良好、纯度高的心肌细胞,培养第三天的心肌细胞纯度达90%。用全骨髓贴壁法可获得纯度高、活力好的MSCs,培养第三代的MSCs纯度达90%。(2)和正常心肌细胞相比,2μmol/LDOX诱导4h即可使心肌细胞存活率显著下降[(80.53±1.92)%vs100%,P＜0.01];2μmol/LDOX可诱导心肌细胞凋亡,在4h～48h内细胞凋亡率不断增加[对照组(1.394±0.18)%、4h组(3.65±0.49)%、12h组(8.54±0.64)%、24h组(11.70±1.62)%、48h组(17.80±1.67)%,P＜0.05];2μmol/LDOX诱导心肌细胞4h后,TGF-β1蛋白表达量与对照组之间无明显差异[(2.37±0.21)ng/Lvs(2.23±0.15)ng/L,P＞0.05],而在12h～48h内TGF-β1蛋白表达量明显增加[12h组(2.71±0.12)ng/L,24h组(3.16±0.46)ng/L,48h组(3.60±0.18)ng/L,P＜0.05],且与心肌细胞凋亡率呈正相关,r=0.932。(3)与A组相比,B组心肌细胞凋亡率增加[(49.15±7.05)vs(27.03±4.43)%,P＜0.05];而加入TGF-β1后,C组较B组心肌细胞凋亡率进一步增加[(71.70±5.17)vs(49.15±7.05)%,P＜0.05]。(4)第三代的MSCs可分泌一定量的TGF-β1,检测细胞上清中TGF-β1的浓度为(3.27±0.31)ng/L。(5)成功建立MSCs与DOX损伤心肌细胞的共培养体系。ELISA法检测各组细胞上清中TGF-β1的含量:E组较D组TGF-β1表达量增加[(5.33±0.55)vs(2.78±0.14)ng/L,P＜0.05],F组较E组TGF-β1表达量减少[(3.41±0.46)vs(5.33±0.55)ng/L,P＜0.05]。AnnexinV-FITC/PI流式细胞仪检测各组心肌细胞凋亡率:E组较D组心肌细胞凋亡率下降[(60.70±2.20)vs(69.84±2.84)%,P＜0.05],F组较E组凋亡率进一步下降[(51.58±5.11)vs(60.70±2.20)%,P＜0.05]。WesternBlot检测各组心肌细胞Caspase-9蛋白表达水平:E组较D组Caspase-9蛋白表达水平下降[(0.587±0.003)vs(0.671±0.005),P＜0.05],F组较E组Caspase-9蛋白表达水平进一步下降[(0.456±0.002)vs(0.587±0.003),P＜0.05]。
结论:MSCs可以通过旁分泌效应减少DOX引起的心肌细胞凋亡,但其旁分泌的细胞因子TGF-β1在DOX诱导的心肌细胞凋亡中起促进作用。特异性抑制TGF-β1的作用,可以进一步降低心肌细胞凋亡率,更大程度上提高MSCs的移植效率,其机制可能与抑制Caspase-9介导的线粒体凋亡途径有关。