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本研究采用DALP(Direct Amplification of Length Polymorphism)与EST-SSR两种不同的分子标记,对34个黄花蒿Artemisia annua L.居群及1个蒌蒿Artemisiaselengensis Turez.居群进行遗传多样性研究,建立了黄花蒿EST-SSR体系,讨论两种不同的分子标记在黄花蒿遗传结构研究的优缺点,试图为黄花蒿居群遗传背景研究提供一些基础资料。本文的研究结果概括如下:
从NCBI网站的EST数据库下载了符合条件的85412条黄花蒿EST序列,去除低质量的和冗余的序列后,得到全长为37,941,082bp的无冗余序列Unigene47936条。其中包括由EST拼接的Contig序列25770条,单一的EST序列(singlet)22166条,平均冗余率为56.12％。从无冗余序列中挖掘到23673条,共30161个SSR位点,平均相隔1257bp出现一个SSR位点。这些SSR位点在Unigene出现频率是49.38％,其中19045条含单个SSR,4628条含2个或2个以上的SSR,EST序列含有SSR位点的频率为35.31％主要的重复单元为三核苷酸重复。
从获得的EST-SSR位点中选择部分序列,设计了40对引物。经过引物筛选,有扩增产物的引物对为28对,占总设计引物数的70％；其中扩增产物基本符合预期产物大小的有23对,占总设计引物数的57.5％。
采用EST-SSR检测黄花蒿34个居群遗传结构,10组引物共检测到241个位点,其中多态位点240个,多态位点百分比PPB为99.59％。总的观察等位基因数Na为1.9959,平均1.4404；总的有效等位基因数Ne为1.2874,平均1.1945；Neis基因多样性指数H为0.1941,平均0.1213:总的Shannons多样性指数J为0.3223,平均0.1904；居群总的基因多样度Ht为0.1941,居群内基因多样性度Hs为0.1213。基因分化系数Gst为0.3752,即遗传变异有37.52％来自居群间,62.48％来自居群内。结果表明黄花蒿居群间功能基因存在明显遗传分化,基因流低落(Nm=0.8326<1)。
采用DALP检测黄花蒿34个居群遗传结构,5组引物共检测到301个位点,其中多态位点299个,多态位点百分比PPB为99.34％。总的观察等位基因数Na为1.9934,平均1.2951；总的有效等位基因数Ne为1.3663,平均1.2711；Nei’s基因多样性指数H为0.2365,平均0.0804；总的Shannons多样性指数I为0.3798,平均0.1268；总基因多样度Ht为0.2365,种内基因多样性指数Hs为0.0804,基因分化系数Gst为0.6602,即遗传变异有66.02％来自居群间,仅33.98％来自居群内,结果表明黄花蒿居群间全基因组存在巨大的遗传分化,基因流明显受到阻碍(Nm=0.2573<1)。
ITS系统树和遗传距离分析表明,黄花蒿的ITS序列基本无差异,萎蒿的鉴定是正确的。ITS系统树可以把黄花蒿和与其相近的蒿属植物区分开,证明了ITS序列分析技术可以作为黄花蒿分子鉴定的依据。