论文部分内容阅读
苹果蠹蛾(Cydia pomonella)属鳞翅目卷蛾科小卷蛾属。幼虫以蛀食苹果、梨等水果为食,具有极强的适应性和繁殖能力。在我国主要分布在新疆、甘肃等地,并有向内地扩增的趋势。当前常规的防控手段对苹果蠹蛾的杀伤作用较小,这种情况对我国水果的产量、质量和果品贸易构成严重威胁。RNA干扰(RNAinterference,RNAi)是近年来兴起的基因沉默技术,在农业害虫领域主要是通过给虫体饲喂含双链RNA(Double-stranded RNA,dsRNA)的食物沉默关键基因的表达,从而达到杀死害虫的目的。但是这种方式在不同虫体间的沉默效果不同,以鳞翅目为主的昆虫如苹果蠹蛾、家蚕、亚洲玉米螟等基因沉默的效率很差,主要原因是在饲喂过程中大量的dsRNA被核酸酶降解。本研究旨在探讨苹果蠹蛾核酸降解酶(RNase)与RNAi效率之间的关系,建立苹果蠹蛾RNAi体系,最终达到杀灭害虫的目的。首先,根据苹果蠹蛾转录组测序结果,筛选出RNase1、RNase2、RNase3和RNase4四个基因,设计相应的引物扩增全长基因序列并进行测序验证。荧光定量PCR结果显示,RNase1和RNase4基因在苹果蠹蛾的中肠组织中高表达,RNase3基因在唾液腺组织中高表达,而RNase2基因在不同组织均有不同程度的表达。生物信息学分析表明,这四种RNase的氨基酸序列在鳞翅目昆虫中具有一定的保守性,存在一个共同的结构域,主要负责对核酸序列的切割和降解。其次,体外检测 RNase 酶蛋白对 EGFP 双链 RNA(Double-stranded EGFP,dsEGFP)的降解作用。解剖实验证明,在苹果蠹蛾不同组织同比例稀释50-100倍的情况下,唾液腺、肠道和血淋巴都具有显著降解dsEGFP的能力。与此同时,本研究还构建了四个RNase基因的原核表达载体,将诱导表达的细菌裂解液与dsEGFP反应,结果显示RNase2蛋白具有降解dsEGFP的功能。最后,本研究以细胞凋亡抑制蛋白(Inhibitor of apoptosis proteins,IAP)基因作为研究对象,检测在RNase表达水平下降时目的基因的RNAi效率。结果显示,在苹果蠹蛾RNase基因为正常水平时,分别注射和饲喂1卩g IAP双链RNA(Double-stranded IAP,dsIAP),IAP基因的表达水平均未发生显著变化。将人工合成的四种RNase的小干扰RNA(Small interferingRNA,siRNA)分别注射到苹果蠹蛾体内,并在两天后检测沉默效果。结果显示,RNase1基因的表达水平相比对照增加到152%,RNase2、RNase3和RNase4基因各自的表达水平相比对照减少到31%、39%和11%。在RNase2、RNase3和RNase4基因被敲减的情况下,我们再次饲喂等剂量dsIAP,两天后IAP基因的表达水平相比对照减少到38%、28%和56%,说明基因RNase2和RNase3的沉默可以有效提升饲喂dsIAP的干扰效果。综上所述,本研究分析了苹果蠹蛾RNase系基因的结构和功能,并验证敲低RNase2和RNase3基因能够显著提高饲喂dsRNA的干扰效果,从而建立一套有效的沉默苹果蠹蛾基因表达的方法体系,为后期研究苹果蠹蛾的基因功能和创新防控手段提供重要支撑,此方式也为其他鳞翅目昆虫的基因沉默提供了参考依据。