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一、研究背景与目的肝外胆汁淤积常由于一些恶性肿瘤、肝外胆管结石阻塞胆管或先天胆道闭锁导致胆汁流出受阻，胆汁积聚肝内，疏水性的胆汁酸引起肝细胞凋亡和坏死，最后可导致肝纤维化和肝硬化。对一些胆管阻塞时间长，黄疸程度深的患者，不仅手术耐受能力低，即使胆道梗阻解除了，术后肝功能仍然恢复慢，甚至出现肝功能进一步损害，造成临床治疗失败。因此，胆汁淤积如何引起肝脏功能损害，一直是国内外学者关注的热点。氧化应激和线粒体功能障碍涉及到慢性肝脏胆汁淤积的发病机制，线粒体DNA(mitochondrial DNA,mtDNA)对氧化应激高度敏感，极易发生氧化损伤。一旦mtDNA损伤超过某个阈值，mtDNA通过其编码的呼吸链亚基对氧化应激具有放大作用，这样会加重线粒体的氧化损伤直至细胞死亡。线粒体转录因子A（TFAM）具有结合和缠绕mtDNA及解螺旋能力,对维持mtDNA空间构想，调节mtDNA的复制和转录及损伤修复具有重要作用。基于以上研究背景，本课题拟研究肝外胆汁淤积患者肝损伤与肝mtDNA改变的关系，探讨线粒体转录因子A在肝外胆汁淤积中的表达及其对肝细胞mtDNA的保护作用，从而达到保护和改善胆汁淤积患者肝功能的目的。二、材料与方法1．病例标本与细胞系：严格按照入组条件选择12个梗阻性黄疸患者，其中胰腺癌6例，壶腹周围癌4例，胆管癌2例。10个非梗阻性黄疸患者为对照组，其中胰腺癌4例，胆囊结石6例。两组患者在年龄、性别上无统计学差异，所有病例排除病毒性肝炎感染、肝自身免疫性疾病或代谢性疾病；未用过有肝脏毒性的药物；有酒精肝患者也被排除。术中肝组织标本获取过程一致，排除肝门阻断对mtDNA的影响。切取的肝组织标本迅速浸泡于液氮罐中，并保存在-80℃冰箱中。人正常肝细胞株L02购于中国科学院上海细胞所。2．HE染色观察病例标本肝脏组织病理变化；试剂盒检测氧化损伤指标MDA、8-OHdG改变及线粒体功能指标ATP含量的变化；实时荧光定量PCR检测mtDNA及mtDNA转录水平mtRNA改变；免疫组织荧光检测mtDNA氧化损伤指标8-OHdG的变化及mtDNA核样结构(anti-DNA)的改变。3．甘氨酸鹅去氧胆酸（GCDCA）处理L02细胞模拟胆汁淤积体外模型，试剂盒检测LO2细胞线粒体氧化指标ROS、8-OHdG改变、细胞活性和线粒体膜电位、ATP含量的变化；实时荧光定量PCR检测mtDNA及mtDNA转录水平mtRNA改变；免疫组织荧光检测mtDNA氧化损伤指标8-OHdG的变化及mtDNA核样结构(PicoGreen)的改变。4．用实时荧光定量PCR和western-blot检测肝外胆汁淤积患者及GCDCA处理L02细胞后TFAM mRNA和蛋白水平的变化。5．利用重组质粒pEGFP-N1-TFAM、pEGFP-N1-ΔC-TFAM及pEGFP-N1对照，过表达TFAM或ΔC-TFAM后，观察其对GCDCA处理L02细胞mtDNA的拷贝数及转录水平mtRNA的影响;观察过表达TFAM或ΔC-TFAM后对肝细胞线粒体功能的改变；免疫组织荧光检测mtDNA氧化损伤指标8-OHdG的变化及mtDNA核样结构(PicoGreen)的改变。三、结果1．肝外胆汁淤积患者HE：肝索结构紊乱，肝细胞胞浆内胆色素沉积，肝细胞轮廓不清，肿胀，变性坏死，可见空泡样变；肝血窦扩张，胆小管扩张，内见胆汁淤积，小叶内见大量炎性细胞浸润。与对照组相比，肝外胆汁淤积患者MDA升高4倍，ATP生成减少37%，肝组织线粒体内8-OHdG定量检测升高9.9倍（p <0.01）。免疫荧光检测胆汁淤积患者肝细胞mtDNA均发现有明显的氧化损伤，而对照组未发现有氧化损伤。实时定量PCR显示胆汁淤积患者肝组织mtDNA拷贝数较对照组下降了60%（p <0.01），代表mtDNA编码基因转录水平COX1，ND1和ND6均有明显下降（p<0.05），免疫荧光检测肝外胆汁淤积患者mtDNA核样结构明显减少。2．GCDCA处理L02细胞后，随着GCDCA浓度增加，L02细胞线粒体氧化指标ROS含量、8-OHdG水平逐渐增加；肝细胞mtDNA拷贝数及转录水平mtRNA逐渐减少；线粒体功能（CCK-8、膜电位、ATP含量）下降。免疫细胞荧光显示随着GCDCA浓度增加肝细胞内8-OHdG含量逐渐增加而mtDNA核样结构逐渐减少。3．实时定量荧光PCR显示肝外胆汁淤积患者TFAM mRNA表达较对照组明显减少，在GCDCA (50,75,100μM)处理L02细胞6小时后TFAM mRNA表达较对照组分别下降了27%,32%和60%（p <0.05）；Western-blot结果显示，肝外胆汁淤积患者TFAM蛋白表达较对照组明显减少；与对照组相比，GCDCA25μM处理L02细胞6小时后，TFAM蛋白表达无明显变化，但随着GCDCA浓度加大(50,75,100μM)，TFAM蛋白表达逐渐减少，100μM时达最低。4．过表达TFAM后，GCDCA处理的L02细胞mtDNA拷贝数增加及转录水平恢复，肝细胞活力和线粒体功能（膜电位、ATP含量）得到改善。免疫细胞荧光显示肝细胞内8-OHdG含量逐渐下降而mtDNA核样结构逐渐增加。而过表达ΔC-TFAM，由于敲除了TFAM蛋白中具有转录活性的C末端，仅保留其维持mtDNA核样结构和维持拷贝数的功能，故其对肝细胞线粒体功能的改善程度较野生型差。四、结论1．肝mtDNA氧化损伤参与了肝外胆汁淤积患者肝细胞功能损害。2．肝mtDNA损伤归因于线粒体转录因子A的缺失。3．在胆汁淤积进程中，过表达TFAM能保护mtDNA以对抗胆汁酸引起的肝细胞毒作用。其作用机制在于TFAM在维持mtDNA结构和功能方面的复合作用。4．过表达ΔC-TFAM也能保护mtDNA以对抗胆汁酸引起的肝细胞毒作用，但较野生型TFAM作用弱。