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卵母细胞和胚胎冷冻保存是一种有效保护动物遗传资源的方法。利用简便快速的玻璃化冷冻保存技术,可以建立雌性动物基因库、保存珍稀生物资源,为其保护和保存提供了不受时间和地域限制的新途径。本研究以废弃猪卵巢内的卵母细胞为材料。通过玻璃化冷冻技术保存体外成熟培养、体外受精获得的成熟卵细胞和囊胚。使用单细胞凝胶电泳(SCGE)方法和连接介导PCR(LMPCR)技术检测冷冻前后卵母细胞和囊胚的DNA损伤情况。旨在建立一套完善的猪卵母细胞冷冻保存体系和DNA损伤评估方法。为卵母细胞玻璃化冷冻保存和冷冻损伤等研究提供理论依据和实验材料。通过阶段性试验研究,得出结论如下:1.玻璃化冷冻保护剂对体外成熟猪卵母细胞DNA的影响以EDFS40为冷冻保护剂平衡冷冻前体外成熟猪卵母细胞。采用细胞形态观察和单细胞凝胶电泳(彗星电泳)方法检测玻璃化冷冻保护剂对细胞DNA的损伤情况。结果显示:保护剂处理组,细胞形态正常率和DNA异常率分别为63.36%、42.06%;同无保护剂处理对照组84.51%、12.28%的差异显著(P<0.05)。表明冷冻保护剂对猪卵母细胞DNA有一定影响;以彗星电泳检测和CASP软件分析保护剂处理对体外成熟猪卵母细胞的毒性作用。保护剂处理组TailDNA%与HeadDNA%的比值相对较高,表明DNA损伤较高。而在OTM值比较中,保护剂处理组斜率比对照组更大。说明冷冻保护剂对猪卵母细胞DNA有明显细胞毒性作用。2.玻璃化冷冻保存对猪卵母细胞DNA的影响采用EDFS40为保护剂微管法玻璃化冷冻保存体外成熟猪卵母细胞。设EDFS40处理组为对照,检测玻璃化冷冻保存过程对卵母细胞的细胞毒性及DNA损伤作用。冷冻组进行细胞形态检测及DNA异常率为63.36%和42.06%,而对照组为59.02%和25.76%。说明冷冻保存对细胞形态和DNA均有一定的影响。对处理组细胞进行彗星电泳检测分析,通过CASP软件分析所得数据得出冷冻组比保护剂处理组的OTM值较大,表明总体DNA较保护剂处理有明显损伤。运用连接介导PCR技术,对细胞基因组中定位特定p53基因进行断裂检测。结果显示:冷冻组的基因扩增有明显的条带,与预计的片段大小相符。而对照组无处理卵母细胞扩增却很少片段产生,初步确认为冷冻造成p53基因损伤断裂。3.玻璃化冷冻和保护剂对猪囊胚细胞DNA的毒性试验以冷冻效果较好的EDFS40保护剂玻璃化冻存猪囊胚细胞。采用形态评估和彗星电泳方法检测囊胚的形态变化及DNA的损伤情况。目的在于探讨玻璃化冷冻保护剂对囊胚的化学毒性作用和冷冻过程对其DNA的影响。结果显示:经保护剂处理和冷冻的囊胚形态正常率为56.46%和35.84%,有较多出现皱缩和细胞塌陷现象。冷冻组囊胚存活率为25%与对照组44.44%有较大差异(P<0.05)。彗星电泳检测结果:保护剂处理组囊胚DNA异常率为53.45%,冷冻组DNA异常率为79.14%,差异显著(P<0.05)。CASP软件分析得出:冷冻组、处理组和未处理组的OTM值有明显区别,曲线斜率越大,DNA损伤程度越大。实验表明保护剂处理和冷冻过程对囊胚DNA均有较大的影响。