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目的: 探索硼替佐米作用于多发性骨髓瘤细胞株增殖及自噬水平的变化;进一步探讨亲溶酶体剂西拉美新联合硼替佐米对多发性骨髓瘤细胞株的增殖及自噬的影响。 方法: 1、细胞培养:人多发性骨髓瘤细胞株RPMI8226和U266于体外培养。 2、采用CCK-8法检测细胞活性:分别检测不同浓度的硼替佐米(3.0、6.0、9.0、12.0nM)和不同浓度的西拉美新(0.5、1.0μM)处理RPMI8226和U266细胞株不同时间(6h、12h、24h)增殖抑制率,并研究两药物联合作用于多发性骨髓瘤细胞系24h的增殖抑制率变化。 3、采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测自噬相关因子LC3B、Beclin-1、p62、LAMP1的mRNA表达:实验分为空白组、硼替佐米组(6nM)、西拉美新组(1.0μM)、硼替佐米联合西拉美新组4组,分别检测上述各组处理多发性骨髓瘤细胞株24h后自噬相关因子mRNA相对表达量。 4、采用蛋白免疫印迹(Western Blot)法检测自噬相关因子LC3B、Beclin-1、p62、LAMP1的蛋白表达:实验分为空白组、硼替佐米组(6nM)、西拉美新组(1.0μM)、硼替佐米联合西拉美新组4组,分别检测上述各组处理多发性骨髓瘤细胞株24h后自噬相关因子蛋白相对表达量。 结果: 1、采用CCK-8法检测各处理组对多发性骨髓瘤细胞株RPMI8226和U266的细胞活性 不同浓度的硼替佐米(3.0、6.0、9.0、12.0nM)作用RPMI8226和U266细胞株不同时间(6、12、24h)后的增殖抑制率见图1、图2和表1、表2,结果显示随着硼替佐米浓度的增加及作用时间的延长,两个细胞系的增殖抑制率逐渐增高(P<0.05)。两药物不同浓度梯度(硼替佐米:3.0、6.0、9.0、12.0nM;西拉美新:0.5μM、1.0μM)联合作用MM细胞系24h的增殖抑制率见表3和表4。应用析因设计方法分析两药联合作用,结果见表5和表6,发现硼替佐米和西拉美新两药联用对上述多发性骨髓瘤细胞株的增殖有协同抑制作用(P<0.05)。由于观察自噬需求,选取浓度硼替佐米为6.0nM、西拉美新为1.0μM,作用时间24h用于后续实验。 2、经RT-qPCR和Western Blot分别分析硼替佐米联合或不联合西拉美新对多发性骨髓瘤RPMI8226和U266细胞株自噬相关因子mRNA和蛋白表达影响 2.1 硼替佐米单药组对多发性骨髓瘤细胞株自噬相关因子mRNA和蛋白表达:硼替佐米(6nM)处理多发性骨髓瘤RPMI8226和U266细胞株24h后,与空白对照组比较,硼替佐米组自噬相关因子LC3B、Beclin-1、LAMP1的mRNA和蛋白表达上升,p62的mRNA和蛋白表达量下降,各组间比较差异有统计学意义(P<0.05),即硼替佐米可促进多发性骨髓瘤RPMI8226和U266细胞株自噬表达增加(见图3、4、5、6;表7、8、9、10)。 2.2 硼替佐米联合西拉美新组对多发性骨髓瘤细胞株自噬相关因子mRNA和蛋白表达影响:联合用药组与单药组比较,自噬相关因子LC3B、Beclin-1、LAMP1的mRNA和蛋白表达增加,p62的mRNA和蛋白表达量下降,各组间差异有统计学意义(P<0.05),即联合用药组较单药组自噬表达量增加(见图3、4、5、6;表7、8、9、10)。 结论: 1、硼替佐米对多发性骨髓瘤细胞株RPMI8226和U266具有增殖抑制作用,这与硼替佐米诱导的多发性骨髓瘤细胞株自噬表达增强相关; 2、硼替佐米联合西拉美新对多发性骨髓瘤细胞株RPMI8226和U266增殖具有协同抑制作用,且这种协同抑制作用与西拉美新诱导的硼替佐米自噬表达进一步增强相关。