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缺氧是许多重大疾病尤其是脑疾病发生发展的主要诱因。近年来,青藏高原动物对其极端低氧生境适应的生理和遗传机制已受到广大学者的高度关注。牦牛是对青藏高原高寒、低氧、枯草期等极端生境适应的唯一大型哺乳动物(海拔4,000 m以上)。水通道蛋白9(AQP9)作为“神经元通道”,其不仅参与脑细胞水和能量底物(甘油、尿素、腺嘌呤、尿嘧啶、乳酸和β-羟基丁酸)的转运,且还参与p53调控相关的细胞凋亡和能量代谢。但到目前为止,尚未见到任何有关牦牛脑AQP9适应低氧功能特征的研究报道。因此,为了探究青藏高原动物对其极端低氧生境适应的分子机制,本论文以牦牛脑作为研究对象,AQP9的结构、表达及其功能特征为突破口,运用基因克隆、载体构建、细胞培养、基因过表达、原位杂交、RT-PCR、免疫组化、免疫荧光及Western blotting等技术,系统分析了牦牛脑AQP9对其极端低氧生境适应的功能特征。结果1.基因克隆和生物信息学分析结果表明,牦牛脑AQP9 CDS全长氨基酸序列与黄牛、藏羚羊、小鼠及人的同源性分别是89.49%、86.10%、74.92%及65.08%;其中除了与上述物种相比均缺失29个氨基酸的差异外,与同源性最高的黄牛相比仅有2个氨基酸的差异,即在牦牛的第9位为酸性氨基酸谷氨酸,而黄牛、藏羚羊及小鼠的均为碱性氨基酸赖氨酸;重要的是,牦牛的第273位与藏羚羊的相同均为高疏水性的亮氨酸,而低海拔物种黄牛、小鼠及人的均为低疏水性的脯氨酸;牦牛脑AQP9第191-220位缺失的29个氨基酸片段主要集中在第五次跨膜与第三段胞外区域;且牦牛该蛋白具有较高折叠的二维结构及差异化的三维构象。2.原位杂交定位分析结果表明,在牦牛大脑皮质中,AQP9 mRNA的阳性反应产物在其分子层、外颗粒层、外锥体细胞层、内锥体细胞层、内颗粒层及多形层中均有分布,但分子层和颗粒层的着色最深,而多形层的着色最浅,该分布特征与黄牛的基本相似,但总体上牦牛的着色较黄牛的浅;在牦牛大脑海马中,该阳性产物在海马皮质和齿状回颗粒层中均有分布,但齿状回颗粒细胞的着色最深,该分布特征与黄牛的也基本相似,同样牦牛的着色也较黄牛的浅。Western blotting结果表明,牦牛大脑皮质和海马AQP9蛋白的表达均低于黄牛的(P皮质<0.05;P海马>0.05)。3.功能试验分析表明:(1)与转染小鼠和人的相比,转染牦牛PEGFP-AQP9质粒的N2a细胞其绿色荧光的表达最低;(2)与转染小鼠和人的相比,转染牦牛PEGFP-AQP9质粒的大鼠原代培养神经元的胞体较小、轴突与树突的生长明显被抑制,而大多数神经元间未形成正常连接,且更明显地促进了大鼠原代培养神经元的凋亡,尤其在低氧胁迫下;(3)在常氧状态下,与转染小鼠和人的相比,转染牦牛的CAGTAG-AQP9质粒较更能促进N2a细胞的凋亡,然而,在低氧状态下,转染牦牛的CAGTAG-AQP9质粒则较小鼠和人的更能抑制N2a细胞的凋亡;(4)在常氧状态下,牦牛、小鼠及人AQP9的过表达下调Caspase-3,c-fos的蛋白表达,而上调Bax、Bcl-2和p53的蛋白表达,然而,在低氧状态下,牦牛、小鼠及人AQP9的过表达则上调Caspase-3、Bcl-2及c-fos的蛋白表达,而下调Bax和p53的蛋白表达,但不论在常氧还是低氧状态下,牦牛的影响趋势均最小。结论:1.在高原低氧适应中,牦牛脑AQP9独特的结构特征如牦牛和藏羚羊AQP9第273位均为亮氨酸,而黄牛、人和小鼠的均为脯氨酸;牦牛该蛋白的第191-220位缺失29个氨基酸的片段;二级结构较高的折叠及三维差异化的构象是该高原物种脑细胞对其低氧生境适应的重要机制。2.在高原低氧适应中,牦牛脑AQP9的低表达特征(牦牛脑AQP9 mRNA和蛋白的表达水平均低于低海拔物种黄牛的;且牦牛该蛋白真核表达质粒转染的模式细胞系也具有其低表达特征)也是该高原物种脑细胞对其低氧生境适应的重要机制之一。3.在高原低氧适应中,牦牛脑AQP9可能是通过自身的低表达直接或间接参与p53、Bcl-2/Bax值、c-fos及caspase-3等调控抵抗低氧诱导的细胞凋亡来维持其正常功能。