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研究背景糖酵解能力增强是肿瘤能量代谢的基本特征。乳酸是糖酵解过程的主要代谢产物,肿瘤细胞中过量产生的乳酸通过转运载体(MCT)转运至胞外引起微环境中pH值下降,进而增强肿瘤的增殖、侵袭转移和血管生成。CD147是一种在多种肿瘤细胞膜上有增高表达的新型跨膜糖蛋白,在肿瘤的发生和发展过程中发挥与和低pH值微环境几乎相同的作用。有研究证实CD147在肿瘤细胞膜上与MCT共存并控制其表达,可能参与乳酸转运。恶性黑素瘤具有生长速度快、易于发生转移的特点,是恶性程度较高的皮肤肿瘤之一,其皮损外周的pH值在6.4-7.3之间,低于正常皮肤pH值。同时恶性黑素瘤细胞的侵袭和肺转移能力在低pH环境中明显增强。因此,本研究旨在明确CD147分子是否与MCT分子共同参与恶性黑素瘤细胞能量代谢,为CD147分子成为皮肤肿瘤基因治疗的靶分子提供更坚实的理论基础。研究目的1.探讨CD147分子是否参与了恶性黑素瘤细胞糖酵解转运。2.探讨CD147分子参与糖酵解的机制。3.探讨CD147分子参与糖酵解过程的后续作用。研究方法1.运用免疫印迹方法检测正常黑素细胞NHMC,恶性黑素瘤细胞株A375中CD147,MCT1和MCT4的表达水平。2.运用免疫荧光共聚焦显微技术观察A375细胞上CD147分别和MCT1、MCT4的表达共存情况。3.利用pSUPER/CD147siRNA重组质粒转染恶性黑素瘤细胞株A375。4.运用免疫印迹法观察CD147 siRNA转染对A375细胞中MCT1和MCT4表达的影响。5.运用免疫荧光共聚焦显微技术观察CD147 siRNA转染对A375细胞膜上MCT1和MCT4的表达及其与CD147共存的影响。6.应用紫外分光光度计检测CD147 siRNA转染对A375细胞糖酵解过程中乳酸转运的影响。7.应用Sartorius pH计测定CD147 siRNA转染对A375细胞外微环境中pH值的影响。8.运用荧光素-荧光素酶方法检测CD147 siRNA转染对A375细胞中ATP水平的影响。9.运用MTT方法、Transwell小室和ELISA方法细胞生物学和分子生物学常规法分别观察CD147 siRNA以及外源性乳酸对肿瘤细胞增殖、侵袭、VEGF表达的影响。研究结果1.正常黑素细胞NHMC中未检测到CD147、MCT1和MCT4的表达,而恶性黑素瘤细胞株A375中CD147,MCT1和MCT4有明显表达。2.A375细胞中CD147分子分别与MCT1、MCT4在细胞膜上表达共存。3.成功构建了A375细胞稳定转染pSUPER/CD147siRNA重组质粒后的细胞克隆C1和C2,pSUPER-vector空转为对照。4.与A375细胞比较,Cl和C2细胞胞浆和胞膜上的MCT1、MCT4分子表达均显著下降,且与CD147在胞膜上的共表达下调。5. NHMC细胞培养上清中几乎未检测到乳酸,而A375细胞培养上清中有显著增高的乳酸产生。与A375细胞比较,C1和C2细胞外微环境中乳酸水平显著下降至27.2%和22.4%,而pSUPER-vector空转组细胞(A375-vector)外乳酸水平无明显变化。6.A375细胞外pH值为7.19左右,显著低于NHMC细胞外水平(p<0.001)。CD147siRNA干扰了CD147的表达后,其胞外pH值增高,C1和C2细胞中分别约为7.36和7.34。7.与A375细胞比较,C1和C2细胞内ATP的水平显著下降,分别下降到了60.8%和51.9%(P<0.001)。而pSUPER-vector空转组细胞(A375-vector)内的ATP水平与A375细胞相比无显著性差异。8.与A375细胞比较,C1和C2细胞的增殖能力、侵袭能力以及VEGF的表达水平均显著下降。但C1和C2细胞中加入了20mM外源性乳酸后,其增殖能力、侵袭能力以及VEGF的表达水平均有一定程度的恢复。结论1.CD147分子增强了恶性黑素瘤细胞的糖酵解能力。2.CD147分子可能通过影响恶性黑素瘤细胞中MCT1和MCT4在细胞膜上的表达而参与肿瘤细胞的乳酸转运。3.CD147分子可能通过下调肿瘤细胞外pH值影响恶性黑素瘤细胞增殖、侵袭和VEGF生成能力。