论文部分内容阅读
前言：
玉竹[Polygonatumodoratum(Mill.)Druee]是百合科黄精属中草药,药用根茎中含有多糖、黄酮、生物碱、甾体皂甙、甾醇、鞣质、黏液质和强心甙等各类成分,具有多种生物学活性。中医常用于治疗肺胃阴伤、燥热咳嗽、咽干口渴和内热消渴等症。现代药效学研究证明玉竹提取物A可抑制免疫功能,对1型糖尿病模型鼠具有明显的治疗作用。此外,玉竹提取物A尚具有抗凝血作用;玉竹提取物B具有抗肿瘤作用;玉竹提取物C(玉竹多糖)具有抗衰老作用,可以延缓衰老模型鼠细胞及体液免疫功能的衰退;又有实验证明玉竹醇水提取物毒副作用较低。
在正常机体中,各种T细胞亚群相互作用,对免疫系统的功能进行调节,维持机体正常的生理功能。其中主要的是CD4+T细胞和CD8+T细胞的调节作用更为突出重要。CD4+αβT细胞根据分泌细胞因子的不同可分为Th1细胞和Th2细胞两个功能亚群,Th1细胞通过分泌细胞因子干扰素γ(interferongamma,IFN-γ)抑制Th2细胞的功能,介导细胞免疫应答(迟发型超敏反应和CTL的特异性靶细胞)。反之,Th2细胞通过分泌白细胞介素4(interleukin-4,IL-4)和白细胞介素10(IL-10)可下调抗原提呈细胞,抑制Th1细胞增殖和其功能,相对提高体液免疫应答。我们发现玉竹提取物A治疗1型糖尿病模型鼠的主要机制是抑制CD4+Th1细胞活性,增强CD8+T细胞的功能,纠正免疫调节功能失衡。
前期实验己经证实玉竹提取物在一定程度上能刺激小鼠脾脏Th1细胞增殖,通过分泌细胞因子IFN-γ抑制Th2细胞的功能,增强细胞免疫功能。本文旨在进一步研究玉竹提取物对小鼠细胞免疫功能的影响,探讨玉竹提取物对小鼠脾脏αβT细胞和γδT细胞的增殖以及CD4+αβT细胞/CD8+αβT细胞比值的影响,并揭示其作用机制。
实验材料：
一、主要试剂
玉竹提取物粉末(中国医科大学免疫实验室提取),RPMI-1640培养液,胎牛血清,0.01MPBS缓冲液,红细胞裂解液,MTT、DMSO、IFN-γ和IL-4EIASA试剂盒和CFSE等。
二、实验动物
6-8W清洁级雄性BALB/c小鼠,购于中国科学院北京实验动物中心。
实验方法：
1、脾细胞分离及其悬液的制备
颈椎脱位处死小鼠,常规制备脾淋巴细胞悬液,调整细胞浓度至1×107/ml。
2、MTT比色法和标记CFSE检测对小鼠脾淋巴细胞转化的影响
3、流式细胞术检测玉竹提取物对小鼠脾脏αβT和γδT细胞增殖及CD4+αβT细胞/CD8+αβT细胞比值的影响
4、ELISA法检测小鼠脾淋巴细胞培养上清中Th1细胞分泌的IFN-γ以及Th2细胞分泌的IL-4的水平
5、统计学处理
采用SPSS16.0软件分析结果,实验数据以均值士标准差(-x±s)表示,采用独立样本t检验进行组间比较。
结果：
1、玉竹提取物对小鼠脾淋巴细胞增殖的影响
(1)经MTT法检测发现玉竹提取物在各浓度范围内对小鼠脾淋巴细胞均有增殖作用,其中1000νg/ml浓度增殖作用最大(P＜0.01)。没有发现玉竹提取物对小鼠脾淋巴细胞具有直接的细胞毒作用。
(2)选择1000μg/ml的玉竹提取物浓度诱导小鼠脾淋巴增殖,流式细胞仪检测的结果显示实验组小鼠脾淋巴细胞的增殖程度显著高于正常对照组(P＜0.01)。
2、玉竹提取物对小鼠脾脏αβT细胞和γδT细胞增殖的影响
采用β和δ荧光抗体标记,经流式细胞仪检测的结果显示实验组的αβT细胞的数量显著高于正常对照组(P＜0.01)。γδT细胞主要存在于小鼠肠黏膜上皮间和胸腺等部位,脾脏存在的量很少,玉竹提取物激增殖的主要是αβT细胞。
3、玉竹提取物对小鼠脾脏CD4+αβT细胞/CD8+αβT细胞比值的影响
提取小鼠脾淋巴细胞,与玉竹提取物在37℃5%CO2的条件下培养96h,CD4和CD8荧光抗体染色,应用流式细胞仪检测的结果显示实验组CD4+αβT细胞与CD8+αβT细胞比值低于正常对照组(P＜0.05)。
4、玉竹提取物对小鼠脾淋巴细胞IFN-γ和IL-4产生的影响
通过ELISA检测小鼠脾淋巴细胞培养上清中IFN-γ和IL-4含量,结果显示实验组与正常对照组比较,IFN-γ产生的水平显著升高(P＜0.01),而对IL-4的产生没有明显的影响。
结论：
1、玉竹提取物在1000μhg/ml浓度时对小鼠脾脏αβT细胞增殖作用最强。
2、1000μg/ml的浓度玉竹提取物具有降低小鼠脾脏CD4+αβT细胞与CD8+αβT细胞比值的作用,提高CD8+αβT细胞的数量。
3、1000μg/ml浓度的玉竹提取物能有效刺激小鼠脾淋巴细胞释放细胞因子IFN-γ,并呈现一定的剂量依赖关系;而对IL-4的产生没有明显的影响。提示玉竹提取物可能具有提高小鼠脾脏CD8+CTL,的功能。