【摘 要】
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目的:2018年Lancet杂志报道腰痛是近30年间大部分国家成人致残的首要原因,其发病率在不断上升,并强调:腰痛和颈部疼痛应成为未来预防和治疗研究的重点。而大部分的腰痛症状来源于椎间盘退变,但目前椎间盘退变的病理机制尚未阐明。最新研究表明NPMSC(nucleus pulposus-derived mesenchymal stem cell)凋亡是引起椎间盘退变的重要原因,我们通过探究柚苷对人退
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目的:2018年Lancet杂志报道腰痛是近30年间大部分国家成人致残的首要原因,其发病率在不断上升,并强调:腰痛和颈部疼痛应成为未来预防和治疗研究的重点。而大部分的腰痛症状来源于椎间盘退变,但目前椎间盘退变的病理机制尚未阐明。最新研究表明NPMSC(nucleus pulposus-derived mesenchymal stem cell)凋亡是引起椎间盘退变的重要原因,我们通过探究柚苷对人退变腰椎间盘来源的髓核间充质干细胞(human nucleus pulposus-derived mesenchymal stem cell,hNPMSC)凋亡等生物学性能方面的影响及其可能机制,揭示椎间盘退变的病理机制,为防治椎间盘退变性疾病的发生及发展提供新的理论依据。方法:收集因腰椎间盘突出症行髓核摘除手术患者的髓核标本,显微镜下分离除去标本中混杂的韧带及纤维环组织,获取髓核组织。无菌状态下分离获取细胞并进行体外扩增培养。通过细胞形态学观察、细胞表面抗原表型检测及诱导其成骨、成脂及成软骨分化能力评估进行间充质干细胞的鉴定。以不同浓度(0μg/m L、0.8μg/m L、4μg/m L、20μg/m L、100μg/m L及200μg/m L)柚苷干预第3代hNPMSC,通过CCK-8法检测细胞活力评估柚苷对细胞活力的影响,以选取最佳柚苷干预浓度。取P3代hNPMSC分为对照组(正常培养基培养)、柚苷组(以含20μg/m L柚苷的培养基培养)和LY294002组(含20μg/m L柚苷及PI3K/Akt信号通路抑制剂LY294002的培养基培养),培养6d后分别用Annexin-VFITC试剂盒处理后经流式细胞仪检测细胞调亡率,TUNEL荧光试剂盒处理后在荧光显微镜下观察拍照并分析TUNEL染色阳性细胞率,收集不同处理组细胞提取蛋白后测定蛋白浓度,通过Western Blot检测促凋亡相关蛋白Caspase-3和Bax及抑凋亡蛋白Bcl-2及PI3K/Akt信号通路相关蛋白p-Akt、Akt和p53表达水平,通过RT-PCR检测Ⅱ型胶原及蛋白多糖的m RNA表达情况。结果:由人退变椎间盘髓核组织分离培养的原代hNPMSC呈贴壁生长,起初呈不规则多边形,胞核呈圆形,与胞质有明显分界,胞浆较淡,传代后以梭形为主;流式细胞仪鉴定发现细胞高表达干细胞相关阳性表面抗原分子CD73、CD90及CD105,低表达非干性相关表面抗原分子CD45及CD34;成脂诱导后经油红“O”染色可见点状红染的脂滴泡;成骨诱导并用茜素红染色可见大量红染沉积的矿盐;成软骨诱导甲苯胺蓝染色后可见蓝染的软骨样细胞。这些从退变椎间盘髓核中分离的细胞特征符合国际细胞治疗学会关于MSC的鉴定标准。CCK-8结果表明0.8μg/m L-200μg/m L的柚苷处理后hNPMSC细胞活力均增加,且20μg/m L时作用最强。与对照组比较,柚苷组细胞凋亡率、TUNEL染色阳性细胞率、p53、Caspase-3及Bax蛋白表达显著下降,p-Akt及抗凋亡蛋白Bcl-2表达显著增加,II型胶原及蛋白多糖的m RNA表达显著增加;LY294002预处理后可以逆转这种改变。结论:柚苷可以通过激活PI3K/Akt信号通路,抑制退变椎间盘髓核来源的hNPMSC凋亡,并在一定程度上促进hNPMSC向髓核细胞分化。
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