第一部分:2-甲氧雌二醇在早发型子痫前期中的表达及临床意义目的:研究2-甲氧雌二醇(2-ME)在早发型子痫前期患者血清中的表达及其临床意义。方法:选取2014年3月至2017年3月在咸宁市中心医院产检并分娩的孕周大于28周并且小于34周、单胎的子痫前期(PE)孕妇。其中早发型轻度子痫前期病例(EOMPE组)25例,早发型重度子痫前期病例(EOSPE组)25例;随机选取同期单胎孕周<34周早产的健康孕妇(NP组)25例作为正常对照组。收集各组临床资料:患者年龄,孕周,孕产次,BMI,收缩压,舒张压,血脂(甘油三脂、胆固醇、低密度脂蛋白),24小时尿蛋白,肾功能(尿酸、肌酐、尿素氮),乳酸脱氢酶,D-二聚体,以及期待治疗时间、新生儿出生体重及Apgar评分等,并加以统计学分析。采用酶联免疫吸附法(ELISA)检测各组孕妇血清2-ME、可溶性血管内皮生长因子受体-1(sFlt-1)、胎盘生长因子(PIGF)、内皮素-1(ET-1)水平变化;采用硝酸还原酶法测定各组孕妇血清一氧化氮(NO)含量。分析EOSPE组血清2-ME与临床指标的相关性;分析EOSPE组血清2-ME与sFlt-1、PIGF、ET-1、NO水平的相关性。收集NP组和EOSPE组分娩胎盘,利用免疫组化检测胎盘中的儿茶酚胺-O-甲基转移酶(COMT)的表达,RT-PCR和Western Blot法检测胎盘中COMT mRNA和蛋白的表达,并进行统计学分析。结果:1.三组患者年龄、孕产次、孕周、孕前体重指数差异均无统计学意义(P>0.05);收缩压、舒张压、采血日体重指数、血尿酸、血肌酐两两比较,差异均有统计学意义(P<0.05)。EOSPE组孕妇血清尿素氮、甘油三酯、总胆固醇、低密度脂蛋白、乳酸脱氢酶、D-二聚体与NP组比较差异有统计学意义(P<0.05),但EOMPE组血清尿素氮、甘油三酯、乳酸脱氢酶与NP组比较无差异(P>0.05)。分娩孕周、期待治疗时间在EOSPE组和NP组之间差异无统计学意义(P>0.05)。EOSPE组孕妇24小时尿蛋白明显高于EOMPE组,新生儿体重及Apgar评分低于NP组,差异有统计学意义(P<0.05)。2.EOMPE 组孕妇血清 2-ME 水平为(645.2±177.2)pg/ml,EOSPE 组为(525.3±172.6)pg/ml,NP 组为(705.9±157.4)pg/ml;EOSPE 组孕妇血清 2-ME 水平低于 EOMPE 组,低于NP组,差异有统计学意义(P<0.05);但EOMPE组孕妇血清2-ME水平与NP组比较差异无统计学意义(P=0.209)。3.EOMPE 组孕妇血清 sFlt-1 水平为(3413.4±619.7)pg/ml,EOSPE 组为(5199.2±584.0)pg/ml,NP组为(2940.0±465.4)pg/ml;两两比较,差异均有统计学意义(P<0.05)。子痫前期组孕妇血清sFlt-1水平较正常对照组增高,且随病情加重增高明显。4.EOMPE组孕妇血清PIGF水平为(81.5±17.0)pg/ml,EOSPE组为(77.4±23.5)pg/ml,NP组为(110.2±45.0)pg/ml;EOMPE组和EOSPE组孕妇血清PIGF水平均低于NP组(P<0.01),但EOSPE组与EOMPE组比较差异无统计学意义(P=0.861)。5.EOMPE组孕妇血清ET-1水平为(49.7±11.0))pg/ml,NO水平为(63.6±17.9))umol/l EOSPE 组 ET-1 水平为(67.6±11.2)pg/ml,NO 水平为(48.1 ±9.3)umol/l,NP 组 ET-1水平为(32.5±7.2)pg/ml,NO水平为(74.7±21.9)umol/l;两两比较,有统计学差异(P<0.05)。子痫前期组孕妇血清ET-1水平较正常对照组增高,NO水平下降,其中ET-1水平随病情加重增高明显。6.免疫组化检测早发型重度子痫前期组和正常对照组胎盘中COMT表达的结果,两组孕妇胎盘组织中均有COMT表达,但差异无统计学意义(P>0.05)。EOSPE组孕妇胎盘组织中COMTmRNA相对表达量为(0.447±0.152),与NP组(0.467±0.151)比较,差异无统计学意义(P=0.678);EOSPE组孕妇胎盘组织中COMT蛋白表达量(0.8916±0.1020)与 NP 组(0.9240±0.1587)相比亦无差异(P=0.422)。7.早发型重度子痫前期组2-ME水平与收缩压、低密度脂蛋白、甘油三脂、血浆肌酐、尿素氮和24小时蛋白尿是呈负相关;与期待治疗时间呈正相关。相关系数r值分别为-0.648(P<0.01),-0.620(P<0.01),-0.649(P<0.01),-0.615(P<0.01),-0.524(P<0.01),-0.587(P<0.01),0.694(P>0.01)。8.早发型重度子痫前期组2-ME水平与sFlt-1水平呈负相关,与PIGF、NO水平呈正相关,相关系数 r 值分别为-0.645(P<0.01),0.511(P<0.01),0.853(P<0.01);但2-ME水平与ET-1水平无相关性(P=0.146)。结论:早发型重度子痫前期组孕妇血清中2-ME水平较正常对照组降低,胎盘COMT表达与正常对照组比较无差异;早发型重度子痫前期组孕妇血清中2-ME降低的水平与病情严重程度有关。第二部分:早发型重度子痫前期患者血清对人脐静脉内皮细胞的损伤作用目的:探讨早发型重度子痫前期患者血清对人脐静脉内皮细胞增殖、凋亡及分泌功能的影响。以期成功构建子痫前期内皮细胞损伤模型。方法:将人脐静脉内皮细胞HUVEC进行培养及如下分组:10%健康早产孕妇血清刺激组(正常对照组)、10%早发型重度子痫前期患者血清刺激组(PE组),并设置空白对照组(无任何血清刺激)。继续无血清培养基培养24小时后,(1)倒置显微镜下观察各组HUVEC细胞形态变化,(2)采用CCK-8法检测各组细胞增殖能力；(3)采用AnnexinV-FITC/PI双染色,流式细胞仪检测各组血清对细胞凋亡的影响；(4)酶联免疫吸附法测定各组细胞培养上清液中内皮素-1(ET-1)含量;(5)硝酸还原酶法测定培养上清液一氧化氮(NO)含量。所有结果进行统计学分析。结果:(1)倒置显微镜下见:PE组细胞间隙较大,部分细胞皱缩,变圆,细胞间隙增宽,胞质减少,局部区域可见细胞死亡脱落。正常对照组与空白对照组HUVEC细胞大小均匀,胞质丰富;(2)采用CCK-8试剂盒检测各组细胞增殖能力,用OD值表示,PE组(0.5118±0.0782)与正常对照组(0.8966±0.0821)及空白对照组(0.9140±0.1201)比较,细胞增殖能力明显下降,差异有统计学意义(P<0.01);(3)采用Annexin V-FITC/PI试剂盒检测各组细胞凋亡率,PE组细胞凋亡率(16.57±2.25)%与正常对照组(7.88±1.58)%及空白对照组(7.34±1.78)%比较,细胞凋亡率明显增高,差异有统计学意义(P<0.01);(4)PE组细胞培养上清液中ET-1含量(0.5430±0.0952)pg/ml 与正常对照组(0.2423±0.0455)pg/ml 及空白对照组(0.2450±0.0781)pg/ml 比较明显增高,差异有统计学意义(P<0.01);(5)PE组细胞培养上清液中NO浓度(18.18±2.45)umol/l 与正常对照组(27.07±2.78)umol/l 及空白对照组(27.12±1.98)umol/l比较明显降低,有显著统计差异(P<0.01)。结论:早发型重度子痫前期患者血清可使HUVEC细胞增殖率降低,细胞凋亡率增加,细胞ET-1分泌增加,NO含量显著降低,诱发HUVEC细胞损伤。子痫前期内皮细胞损伤模型构建成功。第三部分:2-ME对早发型重度子痫前期患者血清致人脐静脉内皮细胞损伤的保护作用及其初步机制目的:确定2-ME作用于HUVEC细胞的适宜浓度及时间;研究2-ME对早发型重度子痫前期患者血清致人脐静脉内皮细胞损伤的保护作用,并探讨其初步机制。方法:(1)利用10%健康早产孕妇血清(正常对照组)、10%早发型重度子痫前期患者血清(PE组),并各设5个浓度梯度(0、1、2、4、8μM)的2-ME分别培养HUVECs,同时设空白对照组(无任何血清刺激),分别培养至第12h、24h、48h后,采用CCK-8试剂盒检测细胞活力。每组设3个复孔,实验重复6次。筛选2-ME加药适宜浓度和作用时间。(2)倒置显微镜下观察HUVEC细胞形态及结构变化。(3)将HUVEC细胞进行培养及如下分组:10%健康早产孕妇血清刺激(NC组)、10%健康早产孕妇血清刺激+2-ME(NC+2-ME组)、10%早发型重度子痫前期患者血清刺激组(PE组),10%早发型重度子痫前期患者血清刺激+2-ME(PE+2-ME组)并设置空白对照组(无任何血清刺激)。分别作用HUVECs后,酶联免疫吸附法分析测定各组细胞培养上清液中内皮素-1(ET-1)含量,硝酸还原酶法测定培养上清液一氧化氮(NO)含量;(4)采用RT-PCR检测2-ME处理后VEGF、HIF-1α、sFIt-1转录水平变化。(5)酶联免疫吸附法检测细胞2-ME处理后培养上清液中sFlt-1分泌水平变化,Western Blot检测2-ME处理细胞后HIF-1α、VEGF蛋白表达变化。结果:(1)空白对照组和正常对照组相比细胞活力无差异。与正常对照组相比,PE组HUVECs活力显著下降,给予2-ME处理后,HUVECs活力随着2-ME浓度上升而呈现递增的趋势。最终选择2-ME的浓度为4μM,作用时间为24小时。(2)正常对照组和空白对照组培养的HUVEC细胞大小均匀,胞质丰富,多角形或三角形,呈单层镶嵌铺路石状排列;PE组处理的细胞呈典型的损伤改变,胞质减少,细胞间隙较大,部分细胞皱缩,变圆,局部区域可见细胞死亡脱落。PE+2-ME组镜下可见HUVEC细胞损伤获得部分修复,细胞形态呈多角形、椭圆形,排列紧密,细胞边界清楚。(3)ELISA法测定2-ME处理后培养上清液ET-1含量,PE组(0.543±0.058)pg/ml与NC组(0.242±0.010)pg/ml比较,培养上清液ET-1含量明显增高,提示重度子痫前期对细胞的损伤作用,加入2-ME干预后ET-1含量(0.331±0.055)pg/ml明显下降。(4)硝酸还原酶法测定2-ME处理后培养上清液NO含量变化,PE组(18.18±0.38)umol/l与 NC 组(27.12±1.58)umol/l 比较,培养上清液 NO 含量降低,PE+2-ME 组(22.90±1.19)umol/l与PE组比较NO含量明显上升,提示经2-ME处理组可逆转这一变化,导致上清液中NO含量的回升。(5)采用RT-PCR检测2-ME处理后VEGF、HIF-1α、sFIt-1转录水平变化,PE组VEGF转录水平(0.57±0.13)和NC组(0.98±0.07)比较明显降低,差异有统计学意义(P<0.05),而予以2-ME处理后VEGF转录水平(0.84±0.06)增加(P<0.05),提示 2-ME 可逆转 VEGF 转录水平。PE 组 HIF-1α(1.43±0.06)、sFIt-1(1.64±0.10)转录水平和 NC 组 HIF-1α(1.02±0.04)、sFIt-1(0.95±0.05)比较明显增高,差异有统计学意义(P<0.05),而予以2-ME处理后HIF-1α(1.11±0.05)、sFIt-1(0.86±0.09)转录水平明显下降(P<0.05),提示2-ME可改善HIF-1α、sFIt-1转录水平。(6)ELISA法检测2-ME处理细胞后细胞培养上清液中sFlt-1分泌水平变化,PE组(540±38)pg/ml和NC组(454±7)pg/ml比较,细胞分泌sFlt-1蛋白含量增高,有显著性差异(P<0.05),而予以2-ME处理后sFlt-1蛋白水平(493±16)pg/ml明显降低(P<0.05)。采用Western Blot检测2-ME处理后VEGF、HIF-1α蛋白表达变化,PE组(37.3±4.0)%和NC(61.9±1.0)%组比较,VEGF蛋白表达降低,有显著性差异(P<0.05),而予以2-ME处理后VEGF蛋白表达(52.4±5.9)%增高(P<0.05)。PE组(92.6±4.0)%和NC组(44.2±1.0)%比较,HIF-1α蛋白表达增高,有显著性差异(P<0.05),而予以2-ME处理后HIF-1α蛋白水平(65.9±4.5)%明显降低(P<0.05)。提示2-ME可逆转VEGF蛋白表达,并降低HIF-1α、sFIt-1蛋白表达。结论:2-ME能够通过增加HUVEC细胞增殖率,减少细胞内皮素-1释放,增加NO合成来改善HUVEC细胞功能损伤。其对HUVEC细胞损伤的保护机制可能是通过下调HIF-1a表达,抑制sFlt-1分泌,促进VEGF生成的途径。