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目的:探讨TGF-β及其下游信号Smad在糖尿病视网膜病变组织纤维化发生发展中的作用。通过研究糖尿病大鼠视网膜组织中TGF-β、Smad2/3、以及其相关蛋白a-SMA、MMP-2、PAI-1、Col-1、VEGF、CTGF的表达变化,揭示糖尿病视网膜病变的TGF-β/Smad信号通路的作用机制,从分子水平完善糖尿病视网膜病变的发病机制,探讨可行的基因治疗或药物防治手段。方法:1.体内实验(1)动物模型建立:雄性SD大鼠,体重200±25g, STZ(美国Sigma公司产品,pH值为4.2,剂量为55mg/kg,溶于0.1mmol/L枸橼酸钠与0.2mmol/L磷酸二氢钠)一次性大量腹腔注射,在48h后采尾血测血糖,后期每2周分别测血糖和体重,将血糖浓度>16.7mmol/L定为糖尿病大鼠。实验动物于第4、8、12周称体重和测血糖后取材。(2)应用RT-PCR, western blotting测定随病程延长检测视网膜中TGF-β、a-SMA、MMP-2、Smad2/3、PAI-1、COL-1、 VEGF、CTGF的定位及mRNA,蛋白的动态变化。2.体外实验:(1)体外培养大鼠视网膜色素上皮细胞,视网膜毛细血管内皮细胞和Muller细胞,取第三代细胞鉴定后作为实验对象。(2)TGF-p的刺激实验:将上述三种细胞以l×104接种于35mmm培养皿,12小时贴壁后,弃上清,每皿加入无血清的RPMI1640,分别加入 1、2.5、5、10、50ng/ml的TGF-β1,分别培养24h,48h,72h。(3)TGF-β对的大鼠视网膜毛细血管内皮细胞、视网膜色素上皮细胞和Muller细胞中TGF-β/Smad信号通路下游蛋白表达的影响。应用Quantitative real-time RNA定量检测相关因子的RNA表达水平,western blotting半定量检测上述因子的蛋白表达水平。结果:1.本研究成功的制备出具有1型糖尿病特征的大鼠模型,并维持数周的体内高血糖环境,即DR动物模型,成模率为83.3%(P<0.05)。 2. RF/6A细胞和ARPE-19细胞在经过不同浓度糖处理,大多因子均在25mM糖处理时表达水平最高。muller细胞经过不同浓度糖处理,各因子均在较高浓度时表达较高。3.在经过25mM糖处理不同时间点后,RF/6A细胞和ARPE-19细胞Q-PCR检测可见各项因子均在25mM糖处理24h时,表达水平达到最高。且Smad3与TGF-β各个时间点表达水平呈现一定的剂量比例。muller细胞中Q-PCR检测各因子均在较长时间时表达较高。4.不同浓度的TGF-β处理,RF/6A细胞Q-PCR检测可见在经过5ngTGF-β处理后,均达到第一个表达高峰。且在不同浓度TGF-β处理后,Smad3与TGF-β表达水平也呈现相似的走势。不同浓度TGF-β处理muller细胞后Q-PCR和western blot检测,可见VEGF、CTGF、COL-1、TGFβ均在5ngTGFβ1处理下达到第一个表达高峰。而a-SMA、PAI、Smad2、MMP2均在50ngTGFβ1处理下达到表达高峰。5.病程1-3月糖尿病大鼠视网膜内各因子的表达变化,可见COL-1、a-SMA、Smad3表达水平与时间呈反比,而TGF-β、Smad2表达水平与时间呈正比。结论:1.按剂量55mg/kg的STZ(将STZ溶于0.1mol/L枸橼酸盐缓冲液中,pH值4.2)一次大剂量给大鼠腹腔注射,给予常规饲料饲养,可成功的制备出具有1型糖尿病特征的大鼠模型,并维持数周的体内高血糖环境,造成糖尿病视网膜病变,即DR动物模型。成模率为84.4%(P<0.05)。2.经不同浓度的糖处理后,可发现体外RF/6A细胞与ARPE-19细胞对于25mM高糖的处理更加敏感,而Muller细胞则对高糖的敏感性较低。3.经25mM葡萄糖处理不同时间后,RF/6A细胞和ARPE-19细胞均在25mM葡萄糖处理24h时,各因子表达水平达到最高。Smad3与TGF-p各个时间点表达水平呈现一定的剂量比例。Muller细胞则对高糖的耐受性更高。4.不同浓度的TGFβ处理后,RF/6A细胞各项因子均在5ngTGF-β处理后,各项因子均达到第一个表达高峰。进一步证实了,在RF/6A和Muller细胞中Smad3作为TGF-β的下游信号因子,与TGF-β的表达水平呈一定剂量依赖性。5.建立稳定的糖尿病1-3月大鼠模型后,可见COL-1、a-SMA、Smad3表达水平与时间呈反比,而TGF-β、Smad2表达水平与时间呈正比。本实验进一步证明了TGF-β/Smad通路在糖尿病视网膜病变发生发展中的作用。