近些年口腔癌发病率逐年增加,其中超过90%的患者被确诊口腔鳞状细胞癌(OSCC)。像大多数癌症一样,OSCC以多步骤的方式进展,从最初表现为癌前病变到最后发展为浸润性癌,其显著特征是异质性的形态特征和区域解剖结构的侵入。作为全世界第六大常见致死肿瘤之一,多数OSCC患者死亡主要是由于原发部位和外周淋巴结转移的局部复发所致。尽管癌症治疗的新技术新方法不断出现尤其是免疫治疗方面,但接受此类治疗的OSCC患者只有50%治愈,而且基于铂类药物治疗后转移复发的病人治疗手段有限,其中位生存期只有6-9月。虽然手术加放化疗依然是现阶段临床上肿瘤治疗的主要手段,然而放化疗中产生的肿瘤耐药现象是肿瘤治疗中最令人头痛的问题,也是肿瘤临床治疗失败的主要原因。因此,探究肿瘤治疗中出现的药物耐受和肿瘤细胞转移复发的原因并阐明肿瘤耐药和转移复发的分子机制对于临床治疗包括OSCC在内的肿瘤尤为重要。长期以来肿瘤被认为是细胞独立于周围环境的自主过程,因此对于肿瘤方面的研究多集中于肿瘤细胞本身。大量证据表明,肿瘤的发生发展与其微环境的改变有着紧密联系,由肿瘤基质细胞及其产生细胞外基质构成的肿瘤微环境和肿瘤细胞之间进行的信息交换促进了肿瘤进展、药物耐受和侵袭性质的获得,也改变着肿瘤微环境的组成。目前已证实肿瘤相关成纤维细胞(CAFs),又称为活化的成纤维细胞或成肌纤维细胞,是肿瘤基质中主要的细胞。在多种肿瘤类型中CAFs的存在与肿瘤患者临床预后有关,并且CAFs可通过多种途径促进肿瘤发生、生长、复发转移和药物耐受。近年研究表明CAFs可通过分泌生长因子、细胞因子和其他物质以自分泌或旁分泌方式作用于肿瘤细胞以及免疫细胞促进肿瘤发展和进展。因此,目前针对CAFs在肿瘤发生发展、复发转移和药物耐受等生物行为中的作用机制以及作为肿瘤治疗新方案的探索备受关注。可是,关于CAFs如何促进OSCC发展和耐药的机制还不完全清楚。长链非编码RNA(lncRNA)是一类转录长度超过200个核苷酸的几乎无蛋白编码功能的RNA。最初数量众多的非编码RNA(ncRNA)被认为是无功能的转录“噪音”,目前认为lncRNA的异常表达与肿瘤等疾病相关,且主要通过作为信号分子、诱饵、引导子和分子支架这四种机制与DNA、染色质、蛋白质和RNAs等生物大分子相互作用,调控基因转录翻译表达、染色质修饰以及细胞核细胞质之间运输等功能。最近证实lncRNA在调控发育、分化和代谢的多个主要生物过程中发挥重要作用,这些研究使已经被忽视的lncRNA备受关注。可是,迄今关于lncRNA与CAFs的关系以及lncRNA在CAFs对OSCC发展、侵袭浸润和药物耐受过程中的具体作用及其机制尚不清楚。为此,我们获取了 OSCC患者的正常组织和肿瘤组织样本,分离纯化出配对的间质成纤维细胞,并利用全转录组测序技术对其测序以及进行生物信息学分析。我们筛选出差异性表达的lncRNA LOC100506114,并探究了间质成纤维细胞表达的lncRNALOC100506114与OSCC预后的关系。进一步通过体内体外实验分析了间质成纤维细胞lncRNA LOC100506114的表达对促进OSCC细胞侵袭生长和药物耐受的作用,并阐述了 lncRNA LOC100506114在正常成纤维细胞向CAFs转变过程中的作用机制。通过本研究我们明确了 lncRNA LOC100506114在OSCC组织的间质成纤维细胞转变以及OSCC发生发展和药物耐受过程中的作用及其机制,为OSCC等肿瘤临床治疗提供了新的策略和途径。1.lncRNA LOC100506114在间质成纤维细胞向CAFs转化中高表达:作为参与肿瘤微环境形成的主要成员,包括CAFs在内的间质成纤维细胞在肿瘤发展、侵袭转移的发生和药物耐受产生等方面发挥着重要作用。为了探讨间质成纤维细胞由静息状态向过度活化状态转变过程中lncRNA所扮演的角色和由静息成纤维细胞转变而来的CAFs对OSCC细胞迁移增殖的影响,本研究首先对来自不同OSCC病人的肿瘤组织及其配对的正常组织的成纤维细胞即CAFs和正常成纤维细胞(NFs)分离培养并对其形态和公认的表型标志表达进行比较分析。另外,我们对5例配对的NFs和CAFs进行转录组测序分析,筛选出显著差异性表达的lncRNA。结果显示,NFs与CAFs在形态上和表型标志表达上存在着明显的差异,且在lncRNA 水平上CAFs与NFs相比lncRN LOC100506114表达差异最大。通过Q-PCR、免疫荧光和RNA-FISH技术对lncRNALOC100506114在组织和细胞水平的分布和表达进行验证和评估。结果与转录组测序结果一致,lncRNA LOC100506114在CAFs的表达显著高于NFs。与OSCC细胞系相比,CAFs明显高表达lncRNALOC100506114且主要分布在细胞核中,在肿瘤组织基质部分也表现出高水平lncRNALOC100506114。接下来我们分别在NFs和CAFs中过表达或敲低lncRNA LOC100506114来探究对CAFs表型标志的影响。结果显示,lncRNALOC100506114明显影响CAFs表型标志的表达。为了进一步探究CAFs中lncRNA LOC100506114的表达对OSCC细胞迁移增殖的影响,我们通过细胞转染过表达质粒体和小RNA干扰片段(siRNA)过表达和敲低 lncRNA LOC100506114。结果显示,过表达 lncRNA LOC100506114的NFs和lncRNALOC100506114敲低的CAFs明显促进或抑制了 OSCC细胞迁移。另外,通过慢病毒载体构建稳定干扰lncRNA LOC100506114的CAFs并与OSCC细胞一起皮下注射构建小鼠移植瘤模型,在体内探究CAFs中lncRNA LOC100506114对OSCC发展的影响。结果显示,lncRNALOC100506114的敲低明显抑制了 CAFs促进肿瘤生长的作用,且小鼠外周血、脾脏以及肿瘤中的MDSCs数目随之减少。这些结果表明lncRNALOC100506114促进了 CAFs表型标志的表达并且CAFs中lncRNA LOC100506114的表达促进OSCC细胞迁移增殖。2.表达 lncRNA LOC100506114 的 CAFs 通过激活 GDF10/TGFβR1 通路促进OSCC细胞迁移和增殖为了探究CAFs中lncRNA LOC100506114的表达影响OSCC细胞迁移和增殖的作用机制,我们通过生物信息学对转录组测序结果进行基因共表达分析并筛选出一些与细胞生长和侵袭相关的基因。通过在细胞水平上验证基因共表达分析筛选出的基因,我们发现GDF10、MEGF10和WNT2表达差异显著。接下来我们分别在NFs和CAFs上过表达或敲低lncRNALOC100506114探究其对GDF10、MEGF10和WNT2的表达调控。结果显示GDF10变化倍数最大,且GDF10在蛋白水平上也受lncRNA LOC100506114表达的影响。此外,我们检测了 CAFs和OSCC细胞以及组织中的GDF10表达水平。有趣的是,GDF10在CAFs中的表达显著高于OSCC细胞。另外,组织水平上我们也检测出在高表达lncRNA LOC100506114的OSCC病人来源的肿瘤组织中GDF10明显高于lncRNA LOC100506114表达低的肿瘤组织,无论在成对的NFs和CAFs还是在肿瘤组织中GDF10的表达显著与lncRNALOC100506114的表达成正相关。lncRNA可以通过与目的基因的顺式调控因子作用调控目的基因表达参与细胞生物过程的作用机制,因此我们推测lncRNA LOC100506114可能通过与目的基因的转录因子相互作用调节GDF10的表达。Runx2转录因子在器官发发生和细胞分化中发挥重要作用且涉及GDF10在肿瘤中表达,我们发现lncRNALOC100506114的表达影响Runx2的表达且lncRNALOC100506114能与Runx2相结合。GDF10是TGFβ超家族成员之一与BMP3高度同源又称为BMP3B。GDF10作为一类与组织器官生长发育分化相关的可分泌性生长因子,在细胞分化迁移增殖方面发挥重要调节作用,并且参与肿瘤发生和转移。现有的研究主要集中在肿瘤细胞中GDF10的表达且在非小细胞肺癌和OSCC中低表达,这些证据显示在肿瘤中发挥作用的GDF10来自于肿瘤细胞之外,而肿瘤基质细胞中研究仍是空白。为了探究CAFs分泌的GDF10对OSCC细胞迁移增殖的作用,我们通过外源GDF10刺激OSCC细胞和转染siRNA-GDF10的CAFs与OSCC细胞共培实验。结果显示,外源GDF10促进OSCC细胞的迁移而转染siRNA-GDF10的CAFs与OSCC细胞共培则抑制了 OSCC细胞的迁移,且通过TGFβR1-SMAD3-ERK信号通路发挥作用,GDF10促进OSCC细胞的生长。另外,我们发现外源GDF10促进了 NFs的α-SMA的表达,敲低GDF10抑制了 CAFs表达FAP和α-SMA。以上结果表明lncRNALOC100506114通过Runx2相互作用调控CAFs中GDF10的表达,促进NFs的恶性转变,并且通过激活TGFβR1-SMAD2/3-ERK信号通路促进OSCC细胞迁移增殖。3.高表达lncRNA LOC100506114的CAFs促进MK分泌,进而调控lncRNA ANRIL的表达促进肿瘤细胞的耐药性越来越多的证据显示CAFs在肿瘤细胞对抗肿瘤药物产生药物耐受的过程中发挥关键作用,阻碍肿瘤治疗。许多有关药物耐受形成机制的研究主要针对肿瘤细胞自身因素,而有关肿瘤基质细胞因素没有受到显著关注。Midkine(MK)是一种肝素结合生长因子,可促进癌变和化疗耐药。基于实验室先前对MK在肿瘤发生中的研究,为了探究CAFs在OSCC对药物耐受产生过程中的作用,我们首先收集来自CAFs、非小细胞肺癌细胞、卵巢癌细胞和OSCC细胞的条件培养基并检测各自MK的分泌情况。结果显示,过表达lncRNA LOC100506114的CAFs中MK的分泌显著高于肿瘤细胞。我们分别通过MK中和抗体、DDP和CAFs来源的条件培养基处理肿瘤细胞探究CAFs分泌的MK对肿瘤细胞耐药的作用,结果显示CAFs分泌的MK促进肿瘤细胞的耐药。在探究MK对OSCC细胞药物耐受形成的作用机制过程中,我们发现OSCC细胞和OSCC组织样本中lncRNA ANRIL高表达,鉴于此我们推测MK通过lncRNA ANRIL促进OSCC细胞耐药。首先我们通过细胞活性实验检测到MIK促进肿瘤细胞耐药性呈时间依赖性。我们进一步发现MK促进lncRNA ANRIL在OSCC等肿瘤细胞中的表达。敲低lncRNA ANRIL显著抑制了 OSCC细胞的增殖和耐药性促进OSCC细胞凋亡的发生。鉴于ABC转运蛋白超家族对肿瘤细胞多药耐受形成方面的重要作用,我们接下来探究lncRNA ANRIL对ABC转运蛋白超家族成员的调控作用。结果显示,lncRNA ANRIL促进ABC转运蛋白超家族成员MRP1和ABCC2的表达。接下来我们检测lncRNA ANRIL对MK在肿瘤细胞耐药性以及抗肿瘤药物诱导的肿瘤细胞凋亡相关蛋白表达的影响。结果显示,lncRNA ANRIL增强了 MK引起的OSCC细胞的药物耐受,通过上调抗凋亡蛋白的表达缓解了顺铂诱导的细胞凋亡,反之则抑制了 MK促进肿瘤细胞药物耐受的作用并且促进了顺铂诱导的细胞凋亡。以上结果显示,肿瘤组织中CAFs分泌的MK在肿瘤细胞药物耐受形成中发挥着主要作用,并且CAFs通过MK调控肿瘤细胞中与肿瘤发生发展相关的lncRNA ANRIL的表达影响药物转运蛋白MRP1和ABCC2,促进肿瘤细胞药物耐受的产生。综上所述,本研究主要探究了肿瘤基质细胞CAFs自身变化及其对肿瘤细胞迁移增殖和药物耐受等方面lncRNA的角色:(1)我们分析了 lncRNA LOC100506114在间质成纤维细胞的CAFs相关表型标志表达和OSCC细胞迁移增殖和药物耐受中的作用;(2)阐明了 CAFs通过lncRNA LOC100506114与Runx2相互作用激活GDF10/TGFβR1信号的潜在分子机制;(3)揭示了表达lncRNA LOC100506114的CAFs通过MK的分泌促进肿瘤细胞药物耐受的作用机制。以上结果提示我们抑制CAFs和抗肿瘤药联合可能作为肿瘤治疗的新策略,CAFs中lncRNA LOC100506114/GDF10未来可作为临床上抑制肿瘤增殖迁移和肿瘤药物耐受的潜在分子靶点。