CCDC3在骨肉瘤中的作用及其调控机制研究

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目的:本项课题旨在分析CCDC3在骨肉瘤中的表达量与普通骨组织中表达量的差别,进而研究CCDC3对骨肉瘤细胞的生物学作用,在明确作用的前提下探索CCDC3对骨肉瘤细胞产生作用的分子机制,从而完善我们对CCDC3以及骨肉瘤的认识。方法:(1)通过对GEO数据库进行数据分析、qRT-PCR等方法,分析CCDC3在骨肉瘤组织和细胞系中的表达量与正常骨来源组织的差异;(2)选用合适的细胞系,通过瞬时调控或者稳定调控等方法制作相应的针对CCDC3的细胞株,用于后续的实验(3)在体外,通过平板克隆实验,细胞增殖曲线绘制等方法,观察CCDC3下调后骨肉瘤细胞的增殖生长情况,分析CCDC3对骨肉瘤的作用;在体内,将处理过的骨肉瘤细胞系种植于裸鼠身上,观察体表肿瘤的大小、形成时间等,分析CCDC3对骨肉瘤细胞在组织水平上增殖,成瘤以及侵袭能力的变化;(4)采用高通量测序技术,比较CCDC3实验组和CCDC3对照组在转录组基因水平上的差别,寻找CCDC3可能存在的下游基因,进而筛选出参与骨肉瘤调控的相关基因;(5)利用荧光定量PCR和Westernblot蛋白印迹实验来验证CCDC3介导骨肉瘤发生发展的具体分子机制。结果:(1)在GEO数据库中,相比对照的人正常组织,骨肉瘤样本中的CCDC3的表达量明显增高;(2)在体外,CCDC3表达量下调的骨肉瘤细胞的增殖能力和生长能力明显低于CCDC3表达量未下调的细胞;(3)在体内,CCDC3表达量上调的骨肉瘤细胞在裸鼠腋下的成瘤能力明显高于CCDC3表达量未上调的细胞;(4)包括ULK1,mTOR,LAMP1等在内的5065个差异表达基因的获得则通过对RNA-seq测序结果进行阈值筛选来实现;(5)骨肉瘤细胞的耐药性在调控CCDC3的表达后有了明显的变化,其耐药性随着CCDC3的削减而减弱,随着CCDC3的过表达而增强;(6)骨肉瘤细胞耐药性的调控可能是通过CCDC3调节骨肉瘤细胞自噬来实现的。结论:CCDC3无论在在骨肉瘤组织还是在骨肉瘤细胞中都呈现出一种高表达状态,CCDC3的下调或上调会导致骨肉瘤细胞的增殖能力发生变化,上调时,增殖能力增强,下调时,增殖能力减弱。同时,下调CCDC3使得骨肉瘤细胞U2OS对阿霉素的耐药性下降。另外,CCDC3下调后骨肉瘤细胞的自噬通量发生了变化,自噬被抑制。综合以上两点,我们推测骨肉瘤细胞耐药性的变化与CCDC3调控自噬有关。
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