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人轮状病毒(human rotavirus,HRV)是世界范围内引起5岁以内婴幼儿严重腹泻最主要的病原体,HRV感染是造成婴幼儿腹泻死亡的主要原因。HRV感染的发病率在发达国家和发展中国家间无明显差异,水质和卫生条件的改善并不能明显降低轮状病毒感染的发病率,因此轮状病毒感染已经成为严重的全球公共卫生问题,给世界各国带来沉重的疾病负担和经济负担。目前尚无治疗HRV感染的特效药物,研制疫苗是预防和控制HRV感染的唯一有效途径。世界卫生组织(world healthorganization,WHO)正积极推动不同形式轮状病毒疫苗的研究与开发。
灭活全病毒疫苗是HRV疫苗开发潜在的一种策略。动物实验证明,灭活的轮状病毒可以产生好的免疫效果,这为HRV灭活疫苗的开发提供了科学的实验依据。当前国内外均未见有HRV灭活疫苗进入临床研究或上市销售。本研究开展了HRV灭活疫苗的研发工作,包括HRV灭活疫苗的制备;HRV灭活疫苗在小鼠的免疫保护效果评价;同时还开展了HRV灭活疫苗参与的联合疫苗的免疫效果的初步评价的研究。
首先,灭活P[8]G1和P[2]G3轮状病毒的制备。规模化培养的P[8]G1或P[2]G3轮状病毒收获液,经离心、微滤、超滤和层析等步骤纯化,病毒液中95%以上的蛋白质被去除,SDS—PAGE和western blot分析证明,纯化病毒液含有轮状病毒特异的蛋白,未见其它蛋白条带。0.5ml纯化病毒液中Vero细胞DNA的残余量为100pg~500pg之间。纯化的病毒,结构完整,呈典型的轮状病毒特征,具有感染性,基因组未发生突变。纯化病毒液中加入终浓度0.00925%甲醛,先在56℃加热30min,然后在37℃持续孵育至72h,病毒被完全灭活。灭活的病毒形态结构保持完整,具有免疫原性。
随后,将灭活的P[8]G1轮状病毒与氢氧化铝佐剂吸附,经后肢肌肉注射途径免疫小鼠,评价HRV灭活疫苗在小鼠的免疫效果和保护作用。实验发现,HRV灭活疫苗可以诱发血清IgG和IgA,肠道IgG和IgA及中和抗体等全身和局部体液免疫反应,同时也引起效应Th1和Th2CD4+T淋巴细胞免疫反应。其中中和抗体在体外的中和实验中,可以中和同型感染性Wa株(G1型)轮状病毒和异型感染性SA11株(G3型)轮状病毒,显示一定的交叉保护作用。在小鼠主动和被动攻击保护实验证明,HRV灭活疫苗可有效保护小鼠免受感染性SA11轮状病毒的攻击。
最后,在小鼠模型进行了HRV灭活疫苗参与的联合疫苗的免疫效果评价。实验发现,不同血清型的二价轮状病毒灭活疫苗,在抗原量相同时,与单价疫苗的免疫效果无显著差别。在与甲型肝炎灭活疫苗(inactivated hepatitis A vaccine,iHAV)联合免疫时发现,联合疫苗中iHAV的免疫效果不及单价iHAV理想;而HRV灭活疫苗免疫效果没有受到影响。在与脊髓灰质炎灭活疫苗(inactivated poliovirusvaccine,IPV)联合免疫中发现,联合疫苗中的HRV灭活疫苗诱发IgG水平高于单价疫苗IgG水平;Ⅰ型和Ⅲ型IPV诱导的中和抗体水平高于单独使用的IPV诱导的中和抗体水平,而Ⅱ型IPV诱导的中和抗体水平却不及单独使用的Ⅱ型IPV诱导的中和抗体水平。
本研究初步建立了HRV灭活疫苗纯化和灭活的工艺,并对轮状病毒灭活疫苗的免疫效果和保护作用进行了评价,为HRV灭活疫苗开发提供了实验基础和临床前数据。同时,对轮状病毒参与的联合疫苗的免疫效果进行了评价,为轮状病毒灭活疫苗的应用和联合疫苗的开发做了有益的探索。