背景与研究目的:膀胱过度活动症（overactive bladder,OAB）是一种以尿急症状为主要特征的综合征,也是临床最常见的膀胱储尿期的兴奋性异常,严重影响患者的生活质量。流行病学研究显示,OAB在全球的总发病人数约为4.55亿人次,每年造成的医疗经济负担高达826亿美元。我国OAB的发病率高达15.1%,其中男性发病率约为15.9%。女性约为14.3%。膀胱储尿期兴奋性改变的发病机制非常复杂,尤其是在兴奋功能异常的疾病中的作用及机制仍未完全阐明。逼尿肌过度活动（detrusor overactive,DO）作为OAB的尿动力学表现,也是其发病的重要病理基础。与其它可兴奋细胞一样,膀胱逼尿肌细胞的兴奋也是细胞的动作电位发生变化的结果,在调节细胞动作电位的变化中,Ca2+在可兴奋细胞兴奋性调控中发挥着举足轻重的作用,胞内Ca2+浓度增加将使可兴奋细胞的兴奋性增加。经典瞬时受体电位（canonical transient receptor potential,TRPC）通道是最早被发现的TRP成员,它是一种非选择性的阳离子通道,可以介导Ca2+、Na+等离子内流,在多种细胞的病理生理过程中发挥着重要的作用。TRPC通道家族共分为7个亚型（TRPC1-7）,TRPC3通道作为其中的一个亚型,广泛参与了多种细胞兴奋性的调控。但到目前为止,TRPC3在膀胱兴奋性异常疾病中的作用仍未有相关研究进行报道。NCX家族是一种由细胞膜上的9个跨膜片段组成的双向转运体,共包括NCX1、NCX2和NCX3三个亚型,在调控细胞内Ca2+稳态的平衡中发挥着至关重要的作用。目前研究发现,NCX的转运方向主要由细胞膜电位及胞膜内外的Na+、Ca2+浓度决定。根据离子的转运方向将其分为:介导Na+内流及Ca2+外流的正向转运模式和介导Na+外流及Ca2+内流的反向转运模式。在生理情况下下,NCX正向转运模式介导的Ca2+外排是维持胞内Ca2+稳定的重要途经。研究表明,NCX参与了多种组织（如动脉、静脉、气道、肠道及心脏等）的平滑肌细胞兴奋性的调控,并在它们的病理过程中发挥着重要的作用。NCX1为膀胱中主要表达的亚型,而NCX2和NCX3亚型则主要表达在大脑及骨骼组织中。我们前期研究发现,NCX1介导了细胞内Ca2+浓度的变化,在膀胱兴奋性的调控中发挥着非常重要的作用。经低密度膜分离技术及免疫共沉淀研究发现,TRP通道和NCX是绑定在一起的,使用谷胱甘肽s-转移酶可以解除其绑定状态。降低细胞外的Na+浓度（从137m M到5m M）或使用NCX的阻滞剂KB-R9473几乎完全抑制TRP通道介导的Ca2+内流。既往大量研究表明,TRP和NCX在结构和功能上是相偶联的:在结构上,TRP通过羧基端与NCX1绑定在一起;功能上,当TRP被激活后可以介导细胞膜下局部Na+增加,而细胞膜下局部Na+的堆积将会激活NCX1的反向转运模式,介导Na+外排及Ca2+的内流,使细胞内Ca2+浓度增加,进而参与细胞兴奋性的调控,这一机制在很多的研究中得以证实。本研究以期阐明TRPC3和NCX1在DO中的关系及作用机制,并为临床诊治该类疾病提供理论依据和干预靶点。方法:本研究所使用动物为雌性SD大鼠,通过膀胱出口部分梗阻（partial bladder outflow obstruction,PBOO）的方式建立DO模型,而后通过尿动力学实验验证模型是否构建成功,并对两组大鼠的膀胱的体积及重量进行对比。通过q RT-PCR及western blotting技术检测两组大鼠膀胱NCX1和TRPC3通道的m RNA和蛋白表达水平,并通过免疫组化技术对NCX1和TRPC3在膀胱内的表达进行定位。采用尿动力学及膀胱肌条收缩实验对两组大鼠膀胱的兴奋性进行检测,并加入NCX1的特异性抑制剂SEA0400和TRPC3的特异性抑制剂PYR10进行干预。采用免疫荧光双染和免疫共沉淀技术对大鼠膀胱中NCX1和TRPC3的相互作用关系进行检测。采用钙负载实验检测大鼠膀胱逼尿肌细胞胞内Ca2+浓度,并加入SEA0400和PYR10进行干预。采用单细胞膜片钳技术检测大鼠膀胱逼尿肌细胞胞膜上的NCX电流,并加入PYR10进行干预。结果:1.成功构建大鼠DO模型。共成功构建DO模型大鼠31只,9只大鼠被排除（3只死亡,6只无不稳定收缩）。DO组大鼠膀胱的体积明显大于对照组,其膀胱重量也较对照组明显增加。2.DO组大鼠膀胱内NCX1和TRPC3的m RNA及蛋白表达水平较对照组明显增加,且两种蛋白在大鼠膀胱的全层中均存在表达。3.PYR10可以明显抑制膀胱的兴奋性。尿动力实验发现,加入PYR10后,DO组及对照组大鼠膀胱的排尿间隔（micturition interval,MI）均明显延长,而膀胱最大压（maximum bladder pressure,MBP）则没有明显变化。与对照组相比,PYR10对DO组大鼠膀胱MI的延长作用更加明显。肌条收缩实验发现,加入PYR10后,DO组及对照组大鼠膀胱肌条的收缩力明显降低,而肌条收缩频率没有明显变化。与对照组相比,PYR10对DO组大鼠膀胱肌条收缩力的抑制作用更加明显。4.SEA0400可以明显阻断PYR10对膀胱兴奋性的影响。尿动力实验发现,SEA0400可以延长DO组大鼠膀胱排尿间隔,但对DO组大鼠的最大膀胱压及对照组大鼠膀胱的排尿间隔和最大膀胱压均无明显影响;阻断NCX1后,PYR10对两组大鼠膀胱的排尿间隔和最大膀胱压均无明显影响。肌条收缩实验发现,SEA0400可以降低DO组大鼠膀胱的肌条收缩力,但对DO组大鼠膀胱肌条的收缩频率及对照组的大鼠膀胱肌条收缩力和收缩频率均无明显影响。使用SEA0400阻断NCX1后,PYR10对两组大鼠膀胱肌条的收缩力和收缩频率均无明显影响。5.TRPC3和NCX1在结构和功能上相偶联。免疫共沉淀实验表明,TRPC3和NCX1在功能上相偶联。激光共聚焦免疫荧光双染实验表明,TRPC3和NCX1在结构上共定位。6.SEA0400可以阻断PYR10对大鼠逼尿肌细胞胞内Ca2+浓度的影响。钙负载实验发现,PYR10可以明显降低DO组及对照组大鼠逼尿肌细胞胞内Ca2+浓度;SEA0400可以降低DO组大鼠逼尿肌细胞胞内Ca2+浓度,而不影响对照组大鼠逼尿肌细胞内Ca2+浓度。使用SEA0400阻断NCX1后,PYR10对两组大鼠逼尿肌细胞胞内Ca2+浓度均不再有明显影响。7.PYR10可以明显抑制大鼠逼尿肌细胞的NCX电流。单细胞膜片钳实验表明,SEA0400可以明显抑制大鼠逼尿肌细胞的NCX的电流密度,而DMSO对DO组及对照组大鼠逼尿肌细胞的NCX的电流密度无明显影响。在-100m V～-50m V（正向转运模式）及0m V～+60m V（反向转运模式）的电压范围内,DO组大鼠逼尿肌细胞的NCX的电流强度的绝对值较对照组明显增加。与-100m V（正向转运模式）时的钳制电压相比,+60m V（反向转运模式）时DO组大鼠逼尿肌细胞的NCX电流强度的绝对值增加的更为明显。PYR10可以抑制大鼠逼尿肌细胞的NCX电流的正反向转运模式,且其对反向转运模式的抑制作用较正向转运模式更为明显。结论:1.DO时大鼠膀胱内TRPC3和NCX1的表达明显增加,两者在大鼠膀胱的全层中均存在表达。2.TRPC3通道与大鼠膀胱的兴奋性增加密切相关。阻断TRPC3可以降低大鼠膀胱逼尿肌细胞胞内Ca2+的浓度,进而抑制大鼠膀胱的兴奋性。3.TRPC3和NCX1在结构和功能上相偶联,TRPC3通过激活与其相偶联的NCX1的反向转运模式,介导逼尿肌细胞的Na+的外排及Ca2+的内流,进而引起胞内Ca2+浓度的升高及膀胱兴奋性的增加。