目的:合成一种新型二代嵌合抗原受体的慢病毒载体,并且合成包含所设计嵌合抗原受体基因的慢病毒。所合成得慢病毒感染293T细胞,验证能否高效表达所包含嵌合抗原受体,以期为CEA 阳性肿瘤的免疫治疗奠定研究基础。方法:本实验构建的二代嵌合抗原受体由C2-45胞外抗原结合区、铰链区、跨膜区、共刺激分子CD137和CD3ζ组成。设计引物扩增位于质粒pCLK1中的Hinge-TM-CD137-CD3ζ基因片段,并在其3’端加入Ecor1酶切位点,扩增位于质粒pC2-45中的C2-45基因片段,并且在C2-45基因片段5’端加入Not1酶切位点和信号肽基因片段,最终通过重叠延伸PCR将基因片段C2-45与基因片段Hinge-TM-CD137-CD3ζ拼接在一起,形成嵌合抗原受体C2-45/CAR。多片段一步克隆定向克隆无缝克隆快速克隆试剂盒拼接C2-45/CAR与线性化载体pCDH-CMV-MCS-EF1-GFP-T2A-Puro,形成的质粒pC2-45/CAR经转化、鉴定后,用慢病毒合成试剂盒合成慢病毒LV-C2-45/CAR及慢病毒LV-pCDH,分别测定其病毒滴度,两种慢病毒分别感染293T细胞后,用免疫印迹法检测目的蛋白在293T细胞表面表达状况。结果:CEA单克隆抗体基因片段C2-45和基因片段Hinge-TM-CD137-CD3ζ,通过重叠延伸PCR拼接成嵌合抗原受体C2-45-Hinge-TM-CD137-CD3ζ(C2-45/CAR),C2-45/CAR 和线性化载体 pCDH-CMV-MCS-EF1-GFP-T2A-Puro 通过多片段一步克隆定向克隆无缝克隆快速克隆试剂盒拼接成功,基因测序验证目的基因C2-45/CAR序列正确并且克隆入慢病毒表达载体,慢病毒包装成功,病毒滴度为1× 106TU/mL。慢病毒感染293T细胞后,提取细胞中蛋白质后,Western blot检测显示慢病毒LV-C2-45/CAR感染293T细胞后可见C2-45/CAR表达,分子量约为 23KDa。结论:新型嵌合抗原受体C2-45/CAR慢病毒载体构建成功,且包含嵌合抗原受体C2-45/CAR慢病毒感染293T细胞后,Western blot检测显示目的基因高效表达。本实验为以慢病毒为载体的靶向CEA嵌合抗原受体修饰免疫细胞杀伤CEA阳性肿瘤研究奠定基础。