论文部分内容阅读
HYY-014为新一代具有二糖配基的蒽环类衍生物,该化合物设计原理为：改变环类抗生素糖基链长度和种类,提高药物糖基与DNA双螺旋小沟间的结合位点,从而增加药物-DNA-拓扑异构酶形成的三元复合物的稳定性和选择性。另外分子中含有的氨基基团还可伸出DNA双螺旋的小沟并与另一DNA链或拓扑异构酶II结合。HYY-014相对于其他蒽环类抗生素的优势已在多种肿瘤细胞系体外试验中和多种人类肿瘤异种移植荷瘤裸鼠的体内实验中得到证实。本课题组前期试验结果显示,HYY-014以原形代谢为主,半衰期短于多柔比星和表柔比星,已知C13醇毒性代谢产物显著低于多柔比星,表现为更好的安全性,且与顺铂联合使用毒性不叠加,而药效有协同作用。目的：N建立HYY-014及其代谢物HYY-M3在大鼠血浆中的生物分析方法,并进行大鼠体内药代动力学研究和组织分布研究,为新药临床前研究提供依据。方法：N1.NLC-MS/MS方法测定大鼠血浆中HYY-014及其代谢物HYY-M3的方法学验证N建立LC-MS/MS测定大鼠血浆中HYY-014及其代谢物HYY-M3的方法。色谱条件：色谱柱：Phenomenex Luna 5μ C18(2) 150mm×2.0mm;流动相：乙腈：水(含0.1%甲酸)=28：72,流速：0.2 ml/min;柱温：40-C；进样量：10μl。质谱条件：离子源为电喷雾离子源；电喷雾电压：4.7kV；加热毛细管温度：320-C；源CID：-8V；鞘气(N2)压力：30Arb；辅气(N2)压力：3Arb；碰撞气(Ar)压力：1.0；正离子方式检测,扫描方式为选择反应监测；用于定量的离子分别为：HYY-014 m/z:母离子644.0,子离子331.0,碰撞能33eV；HYY-M3 m/z:母离子646.0,子离子332.7,碰撞能27eV；内标多柔比星m/z.母离子544.0,子离子396.8,碰撞能15eV；扫描时间为0.5s。2.NHYY-014在大鼠体内的药代动力学研究N单次给药：取24只大鼠随机均等分成3组,雌雄各半,经大鼠尾静脉缓慢推注低、中、高剂量组(0.75mg/kg、1.5mg/kg、3.0mg/kg) HYY-014后,分别于给药前(0)和给药后5、15、30 min、1、2、4、8、16、24、36、48、72、96 h从眼眶后静脉丛取血约0.2 m1置于肝素抗凝管,3000 r/min离心15 min后分离血浆,-70-C保存待测。多次给药：取30只大鼠随机均等分成3组,雌雄各半,经大鼠尾静脉缓慢推注低、中、高剂量组(0.75mg/kg、1.5mg/kg、3.0mg/kg) HYY-014,每两周给药-次,连续给药六次。分别于第四次、第五次、第六次给药前(0)和给药后5、15、 30 min, 1、2、4、8、16、24、36、48、72、96 h从眼眶后静脉丛取血约0.2 m1置于肝素抗凝管,3000 r/min离心15 min后分离血浆,-70℃保存待测。3.NHYY-014在大鼠体内的组织分布研究N取64只大鼠随机均等分成8组,雌雄各半,经大鼠尾静脉缓慢推注1.5 mg/kg HYY-014,分别于给药前(0)和给药后5 min、1、4、10、24、72、120 h处死动物,取心脏、肝脏、脾脏、肺、肾脏、胃、脑、小肠、肌肉、脂肪、皮肤、骨骼、睾丸(卵巢)等组织,用滤纸吸干组织表面血液,剪取称重约0.5 g,剪碎后按照1：4(w：v)的比例,加入生理盐水,制成匀浆液,-70-C保存待测。结果：N1.本试验所建立的LC-MS/MS方法经验证,特异性强,灵敏度较高,标准曲线、精密度和准确度、回收率和基质效应、稳定性均达到体内药物分析的要求。该方法可用于HYY-014在大鼠体内药代动力学研究。2.单次给药浓度经DAS3.0统计软件计算药代动力学参数,HYY-014参数结果分别为：Cmax(ng/ml):816.1±333.9、1628.6±618.6、3495.5±1138.2; AUCo-t (ng/ml*h): 1259.4±221.7、2219.5±276.9、4287.1±529.2; T1/2 (h):33.3±8.9、24.4±3.6、24.5±2.8; MRTo-t(h):18.2±1.3、15.1±2.4、15.6±2.1; Vd(L/kg):27.1±8.6、23.4±5.2、24.2±4.4;CL (L/h/kg):0.57±0.11、0.66±0.08、0.68±0.09。0.75mg/kg剂量组血浆中HYY-M3的浓度较低,多数时间点低于定量下限,故未进行统计学分析,1.5mg/kg、3.0mg/kg剂量组大鼠血浆中HYY-M3药代动力学参数分别为：Cmax (ng/ml):2.2±0.6、 3.1±0.6; AUCo-t (ng/ml*h) 103.1±13.7、174.4±19.5;与相同剂量下HYY-014的比值在4%和5%之间。HYY-014药代参数AUCo-t和Cmax在0.75mg/kg至3.0 mg/kg间与给药剂量具有良好的量效关系；采用SPSS17.0统计软件t检验,结果表明不同剂量组药代动力学参数在性别间的差异均无统计学意义。多次给药浓度经DAS3.0统计软件计算药代动力学参数。3.0mg/kg剂量组在实验过程中大部分大鼠死亡,故未进行统计学分析,0.75mg/kg、1.5mg/kg剂量组大鼠血浆中HYY-014药动学参数结果分别为：Cmax (ng/ml):1514.8±181、 2569.2±473.5; AUCo-t (ng/ml*h):1463.5±246.7、2923.6±617.1; T1/2 (h):16.8±3.5、 25.3±4.3; MRTo-t (h):10.5±1.8、16.3±1.6; Vd (L/kg):12.2±3.7、18.3±3.1; CL (L/h/kg):0.50±0.08、0.51±0.12; HYY-M3药动学参数分别为：Cmax (ng/ml): 1.6±0.3、3.5±1.1; AUCo-t(ng/ml*h):88.1±21.7、195.4±64.7;与相同剂量下HYY-014的比值在6%和7%之间。采用SPSS17.0统计软件t检验,不同剂量组HYY-014药代参数AUCo-t、CL在性别间的差异有统计学意义,其他参数未见明显性别差异。3.组织分布结果表明：(1)静脉给予HYY-014后,该药可很快向机体的各组织广泛分布。5 min时,组织中HYY-014浓度依次为：脾>肾>肺>小肠>心脏>卵巢>肝>胃>骨骼>肌肉>脂肪>皮肤>睾丸>脑,其中脾、肾、肺等器官达到最高；1-24 h后各器官浓度均下降(除小肠、肌肉和脂肪外),脾、肾、肺浓度均降低较少；72～120h后,各器官浓度趋于平稳,但仍旧能够检测到,120 h后脾和肺中的浓度较高。皮肤、睾丸、脑均分布较低。(2)HYY-M3在组织分布中从5 min-10 h逐渐升高,5min时脾、骨骼、肌肉和脑中均未检测到HYY-M3,大部分组织在10h或24 h时达到最高浓度,而后逐渐降低,在120 h后仍可检测到。(3)HYY-014和HYY-M3在组织分布中具有明显的靶向性,主要分布在脾、肾、肺、心脏、肝等组织,脾和肺中消除缓慢。(4)HYY-014不易通过血脑屏障。结论：1. LC-MS/MS方法验证结果符合要求,可进行HYY-014在大鼠体内药代动力学生物分析。2.HYY-014在给药剂量范围内吸收满足线性药代动力学特征。3.HYY-014组织分布具有明显的靶向性,主要分布在脾、肾、肺、心脏、肝组织中,不易通过血脑屏障。