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淀粉酶是指能够水解淀粉及其相关化合物的α-1,4糖苷键或者α-1,6糖苷键,生成寡聚糖或者单糖的一类酶。淀粉酶广泛应用于淀粉糖生产、面包烘焙等食品工业,酒精酿造等发酵工业,以及洗涤剂、纺织、制药等工业。当前应用最广泛淀粉酶包括α-淀粉酶,葡萄糖淀粉酶,普鲁兰酶等。本课题建立了产淀粉酶丝状真菌的筛选方法,从河南、云南、上海、湖南、甘肃、贵州全国6省市取土样或者酒曲进行筛选,最终获得12株淀粉酶活力较高的菌株。其中丝状真菌GX-3在50℃条件下仍生长良好,摇瓶液体发酵后测定粗酶液酶学性质显示：真菌GX-3a-淀粉酶活力最适作用pH为4.0,最适作用温度为80℃：提取基因组进行18S rDNA和ITS序列扩增,鉴定结果表明丝状真菌GX-3属于Rhizomucor pusillus。通过反转录PCR,从微小毛霉(Rhizomucor pusillus)GX-3中克隆到α-淀粉酶基因,该基因DNA序列由1572个核苷酸组成,cDNA序列由1416个核苷酸组成；开放阅读框编码471个氨基酸,与诺维信专利(WO2004/055178A1)公布的微小毛霉(Rhizomucor pusillus)a-淀粉酶氨基酸序列相比,有6个氨基酸残基不一致,分别是：Gly31→Ala, Ala127→Thr,Asp135→Gly,Ser263→Thr,Thr365→Ala,Ala39→Thr。采用染色体步移技术和反转录PCR,从Rhizomucor pusillus GX-3中克隆到葡萄糖淀粉酶基因。该基因DNA序列全长1971bp,cDNA序列全长1539bp,开放阅读框编码512个氨基酸,通过Blast比对分析,该葡萄糖淀粉酶与已报道的葡萄糖淀粉酶氨基酸序列最高相似性为51%,是迄今为止第一条来源于微小毛霉的葡萄糖淀粉酶基因。将R.pusillus来源的α-淀粉酶基因和葡萄糖淀粉酶基因分别构建重组表达载体pPIC9KAmy和pPIC9KGLA,转化毕赤酵母KM71；通过抗生素G418浓度梯度筛选,分别得到抗4.0mg/mlG418的高拷贝转化子KM71/9KAmy和KM71/9KGLA;通过诱导表达,重组毕赤酵母KM71/9KAmy蛋白表达量达到1.5mg/mL,a-淀粉酶酶活31279U/ml；重组毕赤酵母KM71/9KGLA蛋白表达量达到0.762mg/mL,葡萄糖淀粉酶酶活为1237U/ml。本课题是首次实现微小毛霉α-淀粉酶和葡萄糖淀粉酶在毕赤酵母中的异源表达,并且获得较高的蛋白表达水平及酶活。分别测定重组α-淀粉酶和葡萄糖淀粉酶的酶学性质,结果表明：α-淀粉酶最适pH为5.0,在pH4.0～9.0之间稳定性较好,在pH4.0条件下孵育30min,残余酶活力83%,在pH9.0条件下孵育30min,残余酶活力90%;最适温度为70℃,并具有较好的热稳定性,在60℃条件下孵育30min,残余活力仍有73%。与当前市场上的国产和诺维信α-淀粉酶成品酶制剂进行比较,微小毛霉α-淀粉酶最适pH偏低,最适温度偏高,且pH稳定性和温度稳定性均有所提高。微小毛霉葡萄糖淀粉酶最适pH为4.0,在pH4.0～9.0之间稳定性较好,在pH4.0条件下孵育30min,残余酶活力71%,在pH9.0条件下孵育30min,残余酶活力89%；最适温度为70℃,60℃以下热稳定性良好,在60℃条件下孵育30min,残余酶活力仍有85%。通过薄层层析和高效液相色谱方法分析表明,微小毛霉α-淀粉酶水解可溶性淀粉(1%,w/v),主要产物是麦芽糖(69%),其次是葡萄糖(22%)；微小毛霉葡萄糖淀粉酶水解可溶性淀粉(1%,w/v)的主要产物是葡萄糖(43%)和麦芽糖(34%)。为了研究R.pusillusα-淀粉酶和葡萄糖淀粉酶水解淀粉的协同作用,构建了重组表达载体pPICZaAmy,并在毕赤酵母中是成功实现分泌表达；然后将该重组质粒pPICZaAmy转入含有葡萄糖淀粉酶基因的重组毕赤酵母KM71/9KGLA,得到同时含有α-淀粉酶和葡萄糖淀粉酶基因的重组酵母KM71/9KGLA-ZaAmy。在相同条件下进行诱导表达,重组毕赤酵母KM71/9KGLA-ZaAmy与KM71/9KGLA相比,蛋白表达水平提高23%,达到0.939mg/ml,糖化酶活力提高79%,达到2218U/ml。因此,a-淀粉酶和葡萄糖淀粉酶在水解淀粉的过程中具有协同作用,即在含有葡萄糖淀粉酶基因的重组毕赤酵母中导入α-淀粉酶基因,有利于提高糖化酶活力。