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怀黄菊是一种多年生宿根兼观赏、食用、茶用、药用和医疗保健等多种功能的草本植物。由于怀黄菊长期进行无性繁殖,在生产中其品质下降且病害严重。为了提高其抗逆性以解决生产上的问题,在前期研究的基础上,本课题以探讨怀黄菊CmTGA1基因的功能为目的,对前期克隆获得的CmTGA1基因进行生物信息学、表达特性和理化性质分析,并在拟南芥和怀黄菊中鉴定其功能。取得的结果如下:
1.对CmTGA1基因进行了生物信息学分析
使用SMART软件及NCBI数据库里的BLAST功能对CmTGA1基因编码的氨基酸序列的分析结果表明,CmTGA1第43-95个氨基酸序列为BRLZ结构域,第125-201位氨基酸为DOG1保守域,使用DNAMAN软件对怀黄菊CmTGA1的氨基酸序列进行多序列比对的结果显示,CmTGA1与这些物种的TGA1氨基酸序列相似度较高(75.88%),尤其是BRLZ保守功能域的序列一致性极高(90.88%)。使用Mega6软件构建进化树表明,怀黄菊CmTGA1与AtTGA1的亲缘关系最近。用ProtParam程序分析CmTGA1编码的蛋白质的基本特性,结果显示,所编码的蛋白质分子属于酸性蛋白和不稳定蛋白。使用NLStradamus预测CmTGA1蛋白核定位信号在N端86-97氨基酸区域。
2.明确了CmTGA1基因在怀黄菊中的时空表达模式
实时荧光定量PCR(quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR)检测结果表明:CmTGA1在根中的表达量显著高于茎、花、叶中的表达。CmTGA1对活体营养型病原(Pst. DC3000)和死体营养型病原(A. sp.)均能响应,对后者响应更为强烈:接种Pst.DC3000后12h,CmTGA1的表达量达到最大值,是对照的6.21倍;A.sp.处理后在第3d达到最大值,是对照的19.75倍。CmTGA1的表达受SA和MeJA的诱导,对SA的诱导更为敏感,在SA处理8h后,表达量达到最大,是对照的9.21倍;在MeJA处理24h时,CmTGA1的表达量最大,是对照的1.54倍。CmTGA1的表达受到NaCl的强烈诱导:NaCl处理怀黄菊1h后,CmTGA1的表达量开始显著升高,是对照的1.60倍,在处理6h后,表达量达到最大,是对照的5.33倍。
3.确定了CmTGA1蛋白在细胞中的位置及转录激活活性
烟草瞬时表达的结果显示:CmTGA1蛋白定位在细胞核内。酵母单杂交结果显示:CmTGA1蛋白的C末端具有转录激活活性。
4.鉴定了CmTGA1提高拟南芥和怀黄菊的抗病性
以前期获得的过表达CmTGA1拟南芥和怀黄菊为材料,经行来了抗病性功能鉴定。接种Pst.DC3000后,过表达CmTGA1拟南芥和菊花明显降低了病症,提高了它们叶片中保护酶(SOD、POD、PAL等)活力水平及其响应基因的表达水平;拟南芥接种A.brassicae和怀黄菊接种A.sp.后,过表达植株也表现出了与上述一致的结果。说明CmTGA1具有提高拟南芥和菊花对病原抗性的功能。
5.鉴定了CmTGA1提高怀黄菊的耐盐性
通过NBT和DAB染色的方法,发现NaCl处理后,CmTGA1过表达植株叶片超氧阴离子含量和H2O2含量明显降低,且随CmTGA1过表达量的增加,二者降低越明显。说明,CmTGA1能使菊花在盐胁迫下体内的活性氧累积得到有效的减少,进而降低盐胁迫造成的氧化损伤,提高其耐盐性。
1.对CmTGA1基因进行了生物信息学分析
使用SMART软件及NCBI数据库里的BLAST功能对CmTGA1基因编码的氨基酸序列的分析结果表明,CmTGA1第43-95个氨基酸序列为BRLZ结构域,第125-201位氨基酸为DOG1保守域,使用DNAMAN软件对怀黄菊CmTGA1的氨基酸序列进行多序列比对的结果显示,CmTGA1与这些物种的TGA1氨基酸序列相似度较高(75.88%),尤其是BRLZ保守功能域的序列一致性极高(90.88%)。使用Mega6软件构建进化树表明,怀黄菊CmTGA1与AtTGA1的亲缘关系最近。用ProtParam程序分析CmTGA1编码的蛋白质的基本特性,结果显示,所编码的蛋白质分子属于酸性蛋白和不稳定蛋白。使用NLStradamus预测CmTGA1蛋白核定位信号在N端86-97氨基酸区域。
2.明确了CmTGA1基因在怀黄菊中的时空表达模式
实时荧光定量PCR(quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR)检测结果表明:CmTGA1在根中的表达量显著高于茎、花、叶中的表达。CmTGA1对活体营养型病原(Pst. DC3000)和死体营养型病原(A. sp.)均能响应,对后者响应更为强烈:接种Pst.DC3000后12h,CmTGA1的表达量达到最大值,是对照的6.21倍;A.sp.处理后在第3d达到最大值,是对照的19.75倍。CmTGA1的表达受SA和MeJA的诱导,对SA的诱导更为敏感,在SA处理8h后,表达量达到最大,是对照的9.21倍;在MeJA处理24h时,CmTGA1的表达量最大,是对照的1.54倍。CmTGA1的表达受到NaCl的强烈诱导:NaCl处理怀黄菊1h后,CmTGA1的表达量开始显著升高,是对照的1.60倍,在处理6h后,表达量达到最大,是对照的5.33倍。
3.确定了CmTGA1蛋白在细胞中的位置及转录激活活性
烟草瞬时表达的结果显示:CmTGA1蛋白定位在细胞核内。酵母单杂交结果显示:CmTGA1蛋白的C末端具有转录激活活性。
4.鉴定了CmTGA1提高拟南芥和怀黄菊的抗病性
以前期获得的过表达CmTGA1拟南芥和怀黄菊为材料,经行来了抗病性功能鉴定。接种Pst.DC3000后,过表达CmTGA1拟南芥和菊花明显降低了病症,提高了它们叶片中保护酶(SOD、POD、PAL等)活力水平及其响应基因的表达水平;拟南芥接种A.brassicae和怀黄菊接种A.sp.后,过表达植株也表现出了与上述一致的结果。说明CmTGA1具有提高拟南芥和菊花对病原抗性的功能。
5.鉴定了CmTGA1提高怀黄菊的耐盐性
通过NBT和DAB染色的方法,发现NaCl处理后,CmTGA1过表达植株叶片超氧阴离子含量和H2O2含量明显降低,且随CmTGA1过表达量的增加,二者降低越明显。说明,CmTGA1能使菊花在盐胁迫下体内的活性氧累积得到有效的减少,进而降低盐胁迫造成的氧化损伤,提高其耐盐性。