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本试验以烟草品种中烟98、中烟99、中烟100、心叶烟、NC89、K326等为试材，开展了以烟草细胞悬浮和发状根培养技术为手段，以生物转化方式生产辅酶Q<,10>为最终目的的实验室研究，以期为今后应用烟草植物细胞和发状根培养技术大规模生产辅酶Q<,10>提供理论依据。
1.本试验研究了6个烟草品种(中烟98、中烟99、中烟100、心叶烟、NC89、K326)的叶片和根系的辅酶Q<,10>含量。结果表明：在烟草幼苗叶片中，以中烟98辅酶Q。。含量最高，NC89次之，心叶烟最低；在烟草幼苗根系中，以中烟99辅酶Q<,10>含量最高，NC89和心叶烟次之，K326最低；中烟99、中烟100、K326、NC89、心叶烟等5个品种的根系辅酶Q<,10>含量均明显高于其叶片中辅酶Q<,10>的含量。
2.进行了烟草辅酶Q<,10>分离、提取方法的优化和比较。乙醇浸提法中，乙醇浓度90％、料液比1：20，回流温度70℃、回流时间120 min为最佳提取方法；丙酮研磨法中，料液比1：3、正己烷萃取的效果最佳；碱皂化法的最佳提取条件为：酸消解pH值为3，料液比为1：10，80℃回流90min时，碱皂化处理pH为11，料液比1：15，回流温度100℃，回流时间：30min时，辅酶Q<,10>含量最高。丙酮研磨正己烷萃取法工艺相对简单，提取效率高，适合辅酶Q<,10>含量的初步测定。
3.以辅酶Q<,10>含量较高的NC89烟草品种为试材，采用烟草细胞悬浮培养技术，对影响烟草细胞生长和辅酶Q<,10>形成的最佳理化条件进行了选择与优化。
(1)通过改变激素配比和培养条件等策略，获得了适合液体悬浮培养的愈伤组织。其中，加入激素NAA和6-BA的MS培养基比加入激素2，4-D和KT的MS培养基更适合诱导烟草愈伤组织的产生；最适继代培养基为MS+NAA 1.0mg/L+6-BA 1.0mg/L+3％蔗糖+0.7％琼脂；光照培养比暗培养更适合烟草愈伤的继代培养。
(2)建立了快速生长的烟草细胞系，通过筛选温度、接种量及激素配比等优化了悬浮培养条件。25℃是适合烟草细胞生长和辅酶Q<,10>合成的温度；细胞最适接种量为3～4g；最适液态培养基激素配比为NAA 1.0 mg/L+6-BA 0.8 mg/L。蔗糖浓度和pH值会影响烟草细胞生长和辅酶Q<,10>形成。蔗糖浓度为3％左右时细胞增长快，细胞生物量大，有利于辅酶Q<,10>积累，辅酶Q<,10>总量高；pH值为5.8～6.4.时适于烟草细胞生长和辅酶Q<,10>合成。
(3)比较了几种植物生长调节剂对烟草细胞生长和辅酶Q<,10>含量的影响。其中，低浓度IAA对细胞生长和辅酶Q<,10>含量均无明显影响，但IAA浓度大于2.0 mg/L时，会抑制细胞生长和辅酶Q<,10>形成；2，4-D使细胞生物量有一定程度的降低，但却能提高辅酶Q<,10>含量，其中2，4-D浓度为0.5 mg/L，辅酶Q<,10>总量高达7.639 mg/L，与对照相比提高了24.27％；KT浓度为0.5 mg/L时，可提高细胞生物量，但辅酶Q<,10>总量变化不明显，KT浓度大于2.0 mg/L时，则对细胞生长不利，辅酶Q<,10>含量有所下降。
(4)研究了几种有机物质和前体物质对烟草细胞生长和辅酶Q<,10>形成的影响。盐酸硫胺素浓度为4.0 mg/L时，细胞干重、辅酶Q<,10>含量及总量最高，分别为23.873g/L、343 μg/g、和8.176 mg/L；L-苯丙氨酸为2.0 mg/L时，对烟草细胞生长没有明显影响，但对辅酶Q<,10>形成有一定的促进作用，最大增幅为22.13％；对羟基苯甲酸浓度低于5.0mg/L时，对烟草细胞生长无明显影响，但可促进辅酶Q<,10>的形成，最大增幅达19.85％；添加L-酪氨酸对细胞生长和辅酶Q<,10>的形成作用不明显。
(5)研究了生长素IAA与几种营养和前体物质正交实验对辅酶Q<,10>合成的影响。最适营养条件为IAAO.5mg/L+盐酸硫胺素4.0mg/L+L-苯丙氨酸1.0mg/L+对羟基苯甲酸5.0mg/L和IAA0.5mg/L+盐酸硫胺素4.0mg/L+L-苯丙氨酸2.0mg/L+对羟基苯甲酸2.0mg/L。
4.利用发根农杆菌ATCC15834菌株在烟草外植体上直接诱导产生发根，在MS固体培养基上建立起发根离体培养系；通过形态结构观察判断法和PCR法检测烟草发状根中发根农杆菌Ri质粒致根基因的转化情况；并就悬浮培养中有利于发状根生长及辅酶Q<,10>合成的影响因子进行了初步的研究。
(1)发根农杆菌转化烟草形成发状根的效率，受发根农杆菌种类、浓度、及烟草品种、叶片发育时期、叶片在菌液中浸泡时间、共培养时间及外源加入不同生长激素等多种因素的影响。采用处于对数生长期的ATCC15834：菌株感染中烟99无菌苗幼嫩叶圆片5min，在pH值5.8的添加0.1mg/L NAA的MS培养基上共培养2d，可达最大转化效率69.35％。
(2)通过发状根形态结构观察发现发状根没有分化出典型的根冠结构；PCR扩增结果表明，发根农杆菌Ri质粒的rol B基因560bp的特异性DNA片段已在烟草发根基因组中整合并得到表达。
(3)在MS固体培养基上建立起发根离体培养系，经连续多代的培养，发根仍保持旺盛生长状态。悬浮培养中烟草发状根的生长及辅酶Q<,10>合成受到基本培养基类型、初始pH值、蔗糖浓度、装液量及激素种类和浓度等因素的影响。1/2 MS培养基，蔗糖20～30g/，DH 6.4，装液量为40mL/100mL是适合烟草发状根液体培养的条件；适当浓度的植物生长调节剂有利于促进发状根生长，增加辅酶Q<,10>积累量，其中工AA浓度为0.5 mg/L、NAA浓度为0.2mg/L、赤霉素GA<,3>浓度为0.5mg/L时，辅酶Q<,10>含量增幅分别为62.26％、23.14％和68.26％。