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目的:旨在建立封闭性脑损伤模型,探讨大黄-黄等配伍应用对脑损伤早期癫痫的作用及作用机制,为临床预防脑外伤后癫痫提供理论依据。方法:将SPF级C57BL/6J雄性小鼠随机分为空白对照组,模型组,大黄-黄芩药对低(1 g·kg-1)、高剂量组(4g·kg-1)及阳性对照组(2.6g·kg-1丙戊酸钠)。除空白对照组外,其余各组均采用自由落体法建立小鼠封闭性颅脑损伤模型,于脑损伤后分别给予相应药物灌胃治疗,连续7d。于末次给药后给予戊四氮(pentylenetetrazole,PTZ)亚惊厥剂量刺激。1.HPLC分析:建立高效液相色谱法对大黄-黄芩配伍药对中黄芩苷、黄芩素、芦荟大黄素、大黄素的含量进行测定,初步对配伍药对进行质量控制。2.行为学方法:通过行为学观察各组小鼠给予致痫剂后的癫痫发作情况,记录每组癫痫强直-阵挛发作的小鼠只数、发作潜伏期及平均发作强度。3.脑电图(electroencephalogram,EEG)分析:通过皮层脑电记录癫痫小鼠的脑部放电图谱,滤除杂波干扰,统计0～20 Hz的脑部放电总和。4.免疫荧光(Immunofluorescence,IF):使用组织切片荧光染色,对海马DG区胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)的阳性细胞计数,并对其荧光密度进行比较。5.Real-time PCR:定量PCR检测各组小鼠海马组织中炎性介质IL-1βmRNA、TNF-αmRNA的表达水平。6.免疫蛋白印迹法(Westernblot):检测海马组织中GFAP、炎性因子(TNF-α、IL-lβ)、凋亡蛋白(Caspase-3、Bax、Bcl-2)及神经元特殊蛋白Na+-K+-2Cl-共转运体-1(NKCC1)的表达水平。结果:1.HPLC:液相图谱分析可见,大黄-黄芩配伍后,黄芩素的含量较黄芩单方略高,其余3种均无明显变化。测定的结果显示,同一批次的样品经相同提取方法处理后,药对中大黄素、芦荟大黄素、黄芩苷、黄芩素4种成分的含量无明显差异。2.行为学:空白组小鼠有部分惊厥行为,无明显异常;模型组小鼠大多数表现为4～5级大发作,其余各给药组小鼠多表现为2～4级的反复小发作。与模型组比较,各药物治疗组癫痫发作潜伏期均显著延长(P<0.01),30min内强直-阵挛发作的小鼠数量明显减少(P<0.01),发作程度也显著降低。且药对高剂量组与丙戊酸钠对照组结果无明显差异(P>0.05)。3.脑电图:空白组小鼠脑电图显示正常,均以基础波为主,无癫痫样放电;而模型组小鼠脑电图则显示明显的阵发性癫痫放电波形,脑电信号表现为异常高频的棘波、尖波、慢波,与空白组比较,差异显著(P<0.001);大黄-黄芩药对低、高剂量组均有不同程度的棘(尖)波出现,且高剂量组在经过较长的潜伏期后才出现癫痫波,与模型组相比,癫痫波的频率显著降低(P<0.001)。而经丙戊酸钠组治疗后的小鼠偶有癫痫样放电出现,与药对高剂量组比较,无统计学意义(P>0.05)。通过对0～20 Hz脑部放电量总和进行统计,结果显示5组脑电图放电量由大到小依次为模型组>大黄-黄芩低剂量组>大黄-黄芩高剂量组>丙戊酸钠组>空白组。4.免疫荧光:荧光镜下显示,与模型组相比,经过大黄-黄芩药对干预后的小鼠海马DG区星形胶质细胞GFAP免疫阳性反应减弱,细胞数量明显减少,且荧光密度也有所降低。经统计学比较,给药组与模型组之间存在显著性差异(P<0.05)。与空白组相比,大黄-黄芩药对高剂量组与阳性对照组GFAP阳性细胞计数差异不大,无统计学意义(P>0.05)。5.Real-timePCR:比较5组小鼠海马组织中TNF-αmRNA、IL-1βmRNA的绝对定量。与空白对照组比较,模型组海马组织中TNF-α mRNA和IL-1β mRNA表达明显增加(P<0.01);药对高剂量组、阳性对照组与空白对照组比较,表达没有显著性变化,差异无统计学意义(p>0.05);与模型组相比,大黄-黄芩药对干预组和阳性对照组TNF-α mRNA、IL-lβ mRNA 表达均有所降低(P<0.05)。6.Westernblot:通过蛋白免疫印迹法检测 GFAP、IL-1β、TNF-α、Caspase-3、Bax、NKCCI表达,发现模型组较空白组明显增高(P<0.01),药对低剂量组、高剂量组、丙戊酸钠组较模型组明显降低(P<0.05),药对高剂量组与丙戊酸钠组间无统计学意义(P>0.05)。结论:1.大黄-黄芩配伍应用可以延长脑损伤早期癫痫小鼠的发作潜伏期,降低发作等级,抑制癫痫样放电波幅、减少放电频率。2.大黄-黄芩配伍可以有效抑制脑损伤早期癫痫小鼠海马DG区GFAP阳性细胞的反应性增多,从而抑制星形胶质细胞的活化、增殖。3.大黄-黄零配伍应用能够通过调控炎症、凋亡相关因子,抑制脑损伤早期癫痫小鼠脑中炎症介质以及凋亡相关因子的释放,从而改善脑损伤早期癫痫带来的继发性脑部功能障碍,达到神经保护作用。