研究背景及目的:　　血管内皮损伤是高血压、冠心病等多种心血管疾病的共同始动因素。目前针对已知的致血管内皮损伤的病理因素采取了多种干预措施，显著地降低了相关疾病的发生，但是仍有相当数量患者的血管内皮损伤未得到改善，提示可能还有其他未知的因素参与。大量研究证实，除了病理因素的直接损伤外，一些间接因素参与和加重了血管内皮损伤，其中血小板活化是最为重要的促进因素之一。活化的血小板通过释放炎症介质等多种机制介导内皮细胞凋亡、坏死，加重内皮损伤。研究发现，肾素-血管紧张素系统的激活在血小板活化中扮演着重要角色。该系统的主要效应物质血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)可以通过结合血小板表面的AngⅡ1型受体(AT1R)引起血小板活化，参与内皮损伤。近年来研究发现，在子痫前期、恶性高血压、难治性高血压等几种以血管内皮损伤为病变基础的患者血清中均存在一种滴度异常增高的AT1R的自身抗体(AT1-AA)。该抗体通过专一识别、结合AT1R的细胞外第二环功能表位肽段(AT1R-ECⅡ)，发挥类受体激动剂样作用;AT1-AA若长期存在大鼠体内，可导致动脉内皮结构及功能的损伤。但是，AT1-AA是直接损伤血管内皮还是通过活化血小板参与内皮损伤并不清楚。已知AT1R激活后通过经典信号转导途径AT1R-Gq-PLC-IP3/DG-PKC，引起级联反应，参与内皮损伤、炎症反应等。如果AT1-AA可以活化血小板，那么该通路是否在其中起了重要作用？另外，AT1-AA作为类激动剂与AngⅡ导致血小板活化的机制之间有何异同尚不清楚。因此，本研究将采用在体和离体的实验方法，观察AT1-AA是否可以导致大鼠血小板活化，如果能，这种活化的特点及机制如何，AT1-AA活化的血小板是否与血管内皮损伤有关？以上问题的解决，可能为血管内皮损伤性疾病的研究以及临床防治提供一定的实验依据。　　研究方法:　　1.在体实验　　1)实验分组　　①AT1-AA被动免疫组（Passive immunized group，n=12）:将提纯后的AT1-AA IgGs按2μg/g体重剂量经鼠尾静脉注入大鼠体内，每10天加强免疫一次，直至免疫32周;　　②溶剂对照组(Vehicle group，n=12):将从AT1-AA阴性的大鼠血清中提纯的IgGs注射到大鼠体内，免疫方法和剂量同AT1-AA组。　　2)实验方法　　采用双抗体夹心酶联免疫吸附(ELISA)法，检测大鼠血清内皮素-1(ET-1)的水平;大血管环技术检测大鼠血管内皮依赖性和非依赖性血管舒张功能;采用流式细胞术测定大鼠血小板表面糖蛋白CD61和CD62p表达;用血凝仪对大鼠凝血功能:活化部分凝血酶原时间(APTT)、凝血酶原时间(PT)、凝血酶时间(TT)进行测定。通过以上实验，从在体水平观察AT1-AA能否活化血小板以及促进血管内皮损伤。　　2.离体实验　　1)实验分组（n=10/每组）　　①Vehicle组;　　②AT1-AA组;　　③AT1-AA+洛沙坦（AT1R阻断剂）组;　　④AngⅡ组　　⑤AngⅡ+洛沙坦组;　　⑥AT1-AA+ AngⅡ组;　　2)实验方法　　采用血小板聚集仪，观察在胶原(Collagen)、ADP、肾上腺素及花生四烯酸作用下，AT1-AA对血小板聚集的影响;Western blot分析AT1-AA刺激的Collagen诱导聚集的血小板，在不同时间点PKCα，PKCβ，PKCα/βⅡ蛋白的表达;流式细胞技术检测AT1-AA对血小板钙释放的影响;采用血小板静态粘附实验检测不同处理组血小板粘附情况;检测AT1-AA刺激血小板聚集后的上清对培养的HUVEC ET-1水平、LDH含量和细胞凋亡的影响。通过以上实验，从离体水平观察AT1-AA对血小板的活化作用，以及AT1-AA激活的血小板对血管内皮细胞的损伤效应。　　研究结果:　　1.AT1-AA被动免疫大鼠模型建立成功后，检测被动免疫大鼠血清中ET-1的含量在免疫3个月后显著增加;并且免疫6个月时胸主动脉环内皮依赖性血管舒张功能下降。提示AT1-AA的长期存在可以导致血管内皮结构和功能障碍。　　2.AT1-AA被动免疫4个月时，大鼠血小板表面粘附分子CD61、CD62p表达增加;被动免疫6个月时，免疫组大鼠血小板最大聚集率明显增强并且血小板数量减少;但免疫结束后，大鼠凝血功能并未见显著改变。以上结果提示，AT1-AA长期存在可以导致血小板活化，但凝血功能可能存在机体许多因素的参与和调节。　　3.离体实验结果显示，AT1-AA不能导致静息血小板聚集，但能增强Collagen诱导的血小板聚集增强，并且洛沙坦能够显著降低这种作用，提示AT1-AA促进血小板聚集是通过与其表面的AT1受体结合而发挥作用。AngⅡ能够直接导致静息血小板聚集，并增强ADP、肾上腺素等刺激剂诱导的血小板聚集，因此与AT1-AA促进血小板聚集的特点不同。另外，在AT1-AA促进血小板聚集的不同时间点，PKCα、PKCβ表达没有明显改变，而p-PKCα/βⅡ含量在聚集3 min时达高峰，5 min时含量有所下降，但仍较聚集前显著升高，呈现不脱敏现象;而AngⅡ刺激血小板聚集时，在聚集1 min，p-PKCα/βⅡ含量显著升高，随后即立即下降。以上结果提示AT1-AA通过AT1R-PKC通路促进了Collagen诱导的血小板聚集。　　4.在Collagen刺激下，AT1-AA可以导致血小板内钙释放增加，但并不能使静息血小板内钙离子浓度增加;AT1-AA可以导致Collagen诱导血小板内ATP释放增加。这些结果提示AT1-AA增强Collagen诱导的血小板聚集可能与血小板内钙释放和ATP释放增加有关。　　5.AT1-AA作用于健康大鼠血小板聚集后，分离上清液，用合成的AT1R-ECⅡ肽段中和上清中的AT1-AA，之后加入培养的HUVEC中，观察到ET-1的释放量呈时间依赖性升高;HUVEC的凋亡增加。以上结果提示AT1-AA可以通过血小板的活化导致血管内皮损伤。　　结论:　　AT1-AA可以诱导在体和离体的血小板活化，该效应可能由AT1R-Gq-PKC通路介导，而且AT1-AA激活的血小板可进一步引起血管内皮损伤。本研究为阐明血管内皮损伤相关疾病的发生发展机制以及临床诊治提供了新的实验依据。