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背景和目的肿瘤生长与转移依赖新生血管的形成,血管内皮生长因子165(vascularendothelial growth factor 165,VEGF 165)是重要的促血管生成因子,在多种肿瘤细胞及组织中都有高表达。最近研究表明,神经纤维素-1(neuropilin-1,NRP-1)不仅参与神经细胞发育,在血管内皮细胞,促使VEGF165与VEGFR2结合,参与调节血管形成和新生。在肿瘤的生长、迁移中发挥重要作用。本课题旨在利用慢病毒介导的RNA干扰(RNA interference,RNAi)技术沉默原发性肝癌细胞株HCCLM6中VEGF165及NRP-1,体外观察对细胞生长的影响;人肝癌裸鼠模型中观察其抑瘤生长及转移的作用。方法流式细胞仪检测慢病毒、脂质体及磁纳米颗粒三种载体对非特异性短发夹样RNA(short hairpin RNA,shRNA)的转染效率,筛选出高效而安全的转染载体;利用DNA重组技术分别构建VEGF165shRNA、NRP-1shRNA表达质粒,并进行克隆鉴定;两种表达质粒经293T细胞包装成熟的慢病毒,以单独及联合的方式感染HCCLM6,48h后流式细胞仪检测转染效率,荧光定量PCR检测各组细胞VEGF165及NRP-1mRNA的表达水平,Western blot检测各组细胞VEGF165及NRP-1蛋白表达水平,MTT法检测各组细胞生长曲线的变化。各组细胞接种裸鼠,建立人肝癌裸鼠模型。观察成瘤时间差异,取皮下瘤称重、测量体积,观察肺转移情况。Western blot检测各组裸鼠皮下瘤组织内VEGF165及NRP-1蛋白的表达水平,免疫组化检测各组裸鼠皮下瘤组织内微血管密度(microvessel density,MVD)。结果1三种载体中,慢病毒载体的转染效率最高(90.1%),脂质体次之(60.8%),磁颗粒最低(30.2%)。慢病毒及脂质体转染后的细胞生长速度较野生型细胞慢,生长曲线较低,但差异无统计学意义(P＞0.05)。磁纳米颗粒转染组细胞生长与野生型细胞无显著性差异(P＞0.05);2挑取阳性克隆经测序证实插入序列正确,包装成熟的两种病毒滴度均为5×10~8/ml;3流式细胞仪检测VEGF165shRNA转染效率高达86.8%,NRP-1shRNA的转染效率达97.7%,共转染组的转染效率达99%;荧光定量PCR结果显示,相对于野生型HCCLM6细胞,VEGF165shRNA转染组、共转染组的VEGF165 mRNA表达抑制率分别为65%、70%,NRP-1shRNA转染组及空载体转染组VEGF165 mRNA的表达不受影响。NRP-1shRNA转染组、共转染组的NRP-1 mRNA表达抑制率分别为81%、80%,VEGF165shRNA转染组及空载体转染组NRP-1 mRNA表达不受影响Western blot结果显示,相对于野生型HCCLM6细胞,VEGF165shRNA转染组、共转染组的VEGF165蛋白表达抑制率分别为57.1%、57.2%(P＜0.05),NRP-1shRNA转染组及空载体转染组VEGF165蛋白表达不受影响(P＞0.05)。NRP-1shRNA转染组、共转染组的NRP-1蛋白表达抑制率分别为74.9%、74.6%(P＜0.05),VEGF165shRNA转染组及空载体转染组NRP-1蛋白表达不受影响(P＞0.05);MTT法检测各组细胞生长曲线显示,相对于野生型HCCLM6细胞,VEGF165shRNA转染组、NRP-1shRNA转染组及共转染组细胞的生长受抑制,共转染组抑制细胞生长作用最为明显(P＜0.05)。空载体转染组细胞生长无明显变化(P＞0.05)。4 NRP-1shRNA转染组、VEGF165shRNA转染组及共转染组裸鼠的肿瘤体积较空白组的明显缩小(均P＜0.05),肿瘤重量也明显减轻(均P＜0.05),空载体组肿瘤的体积及重量与空白组无显著性差异(P＞0.05)。空白组及空载体组6只裸鼠全部发生肺转移,而VEGF165shRNA转染组和NRP-1shRNA转染组有4只裸鼠发生肺转移,共转染组裸鼠肺转移率更低,仅有3只发生肺转移。Western blot结果显示:相对于空白组,VEGF165shRNA转染组、共转染组裸鼠肿瘤组织中VEGF165蛋白表达抑制率分别为56%、56.1%(P＜0.05),空载体组及NRP-1shRNA转染组肿瘤组织VEGF165蛋白表达量不受影响(P＞0.05)。相对于空白组,NRP-1shRNA转染组、共转染组肿瘤组织中的NRP-1蛋白表达抑制率分别为52.2%、54.1%(P＜0.05),VEGF165shRNA转染组及空载体组肿瘤组织中NRP-1蛋白表达量不受影响(P＞0.05)。免疫组化计数MVD:VEGF165shRNA转染组、NRP-1shRNA转染组及共转染组的MVD值明显小于空白组,差异有统计学意义(P＜0.05)。其中共转染组MVD值与VEGF165shRNA转染组、NRP-1shRNA转染组亦有显著性差异(P＜0.05)。而空白组与空载体组MVD值无显著性差异(P＞0.05)。结论VEGF165shRNA慢病毒颗粒与NRP-1shRNA慢病毒颗粒联合感染HCCLM6细胞后,能显著抑制VEGF165及NRP-1的mRNA及蛋白水平的表达,抑制HCCLM6细胞的生长。在人肝癌裸鼠体内,减少裸鼠肿瘤组织中的MVD,实现抑瘤生长及肺转移的作用。