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Ⅰ抗稻瘟病基因pi-d2导入水稻提高稻瘟病抗性的研究水稻稻瘟病是水稻生产中的最严重病害之一，俗称水稻“癌症”。控制稻瘟病害的方法主要是使用杀菌剂和利用抗病品种。植物基因工程的兴起为病害的控制提供了更广泛的选择余地。利用该技术可向现有栽培品种中导入外源抗病基因而不受种属限制，拓展了可利用基因的来源，这无疑为作物抗病育种工作开辟了一条崭新而有效的途径和发展空间。在水稻中已克隆了六个抗病R基因Pi-b、Pi-ta、Pi-9、Pi-2、Piz-t和Pi-d2。前5个基因蛋白属NBS-LRR类蛋白，而Pi-d2具有一个独特的B-lectin而作为新的一类抗病蛋白。本研究首次利用农杆菌介导法将Pi-d2基因转入水稻感病品种丽江新团黑谷、日本晴和抗病品种中花9号等，进行分子生物学检测、GUS活性检测和抗病性鉴定，得到了对稻瘟病抗性提高的水稻材料，为水稻以及其它禾本科植物抗病分子育种奠定基础，并为有性杂交育种提供了基因资源。主要研究结果如下：1以不同水稻品种的幼胚和成熟胚作为外植体，通过农杆菌介导法将目的基因三种不同的表达载体（含有长为3.2kb自身启动子驱动的Pi-d2基因组序列的pCB6.3k、含有长为2.2kb自身启动子驱动的Pi-d2基因组序列的pCB5.3k和35S驱动的Pi-d2基因全长cDNA序列的表达载体pZH01-2.72kb以及阴性对照载体pZH01-tp309）导入到水稻中，获得一批转Pi-d2基因的潮霉素抗性植株。2在农杆菌介导过程中首次将PSK添加在共培养基中提高了转化效率。PSK浓度为10nmol/L时，抗性愈伤出愈率比对照提高最高达11％；当PSK为200noml／L时，几乎完全抑制抗性愈伤的生长。PSK还与筛选培养基中的2，4-D浓度有关，2，4-D为2mg／L比1mg／L更有利抗性愈伤生长。3 PCR、RT-PCR、Southern blot杂交等分子检测结果证明外源基因以1-4个拷贝随机插入水稻基因组中，并在转基因植株中稳定遗传。对转基因植株后代的潮霉素抗性分析表明转基因的整合情况大多为单位点、单拷贝。潮霉素的抗性已稳定传至T2代，获得转基因纯合株系。4对35个独立转基因株系的T1代植株接种结果表明转基因植株对稻瘟病生理小种ZB15的抗性提高，病斑大小和数量减少，抗性呈孟德尔和非孟德尔分离。目的基因三种表达载体在受体中所表现的对ZB15抗性无明显差异。T2代潮霉素抗性植株接种结果表明转基因株系仍然对稻瘟病ZB15具有抗性，3个株系内存在抗感分离，且T1代抗性较好的株系在T2代对稻瘟病仍具有较好的抗性，T1和T2代植株抗稻瘟病性结果较为一致。5连续三年的田间试验表明转基因植株抗穗颈瘟的能力大部分增强；抗叶瘟的转基因株系不一定抗颈瘟。通过田间试验，筛选到高抗稻瘟病株系。6用39个稻瘟病菌株测定转Pi-d2基因9个高代材料的抗谱表明不同转基因株系的抗病频率不同，目的基因在感病植株中的表达抗病频率提高十分明显，最高提高达91.7％。而在抗性品种中花9号中抗病频率基本未提高。用中国农科院收集的58个菌株对四个转基因早代纯合株系的抗谱测定表明转基因品系对81.48％以上菌株表现抗性，具有广谱抗性特点。7通过对目的基因不同三个表达载体在转基因植株中的表达分析，表明Pi-d2基因长为2.2kb或3.2kb自身启动子在转基因植株中具有启动子功能。具有Pi-d2基因基因组序列的转基因植株与具有cDNA序列转基因植株对稻瘟病的抗性都有提高。8对转基因农艺性状考查结果表明除少部分农艺性状发生变化外，大部分转基因植株农艺性状没发生显著变化。对随机抽取的一份转基因进行的稻米营养成分测定，结果表明转基因稻米中的营养成分未发生明显改变。Ⅱ一份条斑和颖花异常水稻突变体研究水稻是单子叶植物的模式植物。对水稻的发育过程进行研究具有重要的理论意义和应用价值。本实验在水稻遗传转化过程中发现一个不含外源基因的条斑和颖花异常的突变体，并对突变体进行了形态和组织学鉴定及遗传分析，为突变基因的克隆打下基础。其研究结果如下：1突变体表型特征：该突变体的茎、叶、穗出现条斑。在分蘖盛期，一些叶片始分岔或卷曲；花器官数目增多，表现为多内外稃，叶片状浆片，或浆片增大，雌蕊增多，颖花开裂。极端表型为同一颖花中长出几朵小花或小花枝梗伸长为花序。2生理特征：叶绿素总含量和净光合速率明显低于野生型。在分蘖中期、开花前期和开花后期三个时期，SOD、POD、CAT与性状表达呈一定的关系。3细胞学特性：透射电镜对叶片白色组织细胞超微结构观察，发现细胞壁内陷，质体结构异常，不能发育出正常叶绿体所具有的片层和类囊体。过渡区的紧靠绿色部分的细胞较大，叶绿体发育相对正常，而靠近白色区的细胞很小，叶绿体的基粒排列紊乱。突变体绿色组织部分中的细胞生长正常。利用扫描电镜对花器官形态发生过程进行观察，内外稃原基正常形成，其后突变体表现出与野生型颖花原基发育明显不同的特征。突变体开始形成额外的内／外稃原基。颖花原基出现不均等分裂，一般为二裂原基，较大部分分化较早，甚至有些颖花原基出现三个不等分裂。在雄蕊原基和内外稃之间，有膨大的浆片原基出现，后发育成类稃状浆片。雄蕊原基发育不同步，原基大小也不一样；花分生组织的较野生型大，并且一些具有永久的活性。4组织学特性：石蜡切片观察生长扭曲的叶片发现有维管束鞘细胞的过度生长，或一些泡状细胞增大。5遗传学特性：通过突变体与4个叶色正常的材料杂交和回交遗传分析，突变性状呈细胞质遗传方式。提取水稻叶绿体基因组DNA，并用180个RAPD引物PCR扩增，共扩增出1100个左右条带，其中两个有片段在突变体和野生型中存在差异。