本文通过对脂肪酶进行荧光标记,使其荧光光谱能够反映出酶在溶液及载体中的构象变化,进而建立了荧光光谱、酶活性和酶构象变化三者的相互关系。首先是在四种荧光探针中筛选出合适的两种荧光探针异硫氰酸酯荧光素(FITC)和罗丹明B(RhB),然后在溶液中分别检测其在不同变性条件下荧光光谱同酶活性之间的关系,最后则是对载体化的荧光标记脂肪酶进行荧光光谱的检测,从而对载体化所用的聚合单体、配体诱导、配体抽提以及各种变性作用等条件对脂肪酶构象的影响加以研究。文中分别对异硫氰酸酯荧光素(FITC)、罗丹明B(RhB)、罗丹明123(Rh123)和罗丹明6G(Rh6G)进行了脂肪酶荧光探针连接的考察,其结果为:在最适温度下,FITC和RhB荧光标记都会使酶活性有所下降,但在其他温度,由于空间位阻效应,其耐热性增强。荧光光谱显示,随温度升高,荧光强度逐渐增大,而发射波长略有红移,说明脂肪酶的空间构象不断变化,因此在检测脂肪酶构象变化方面,FITC和RhB两者都能发挥相应的作用;而脂肪酶连接上Rh6G或Rh123两种荧光探针后,酶就完全失活,因此该两种荧光探针并不适合标记脂肪酶。进一步对在溶液中的FITC和RhB标记的脂肪酶进行各种变性研究,结果表明:在最适温度下,荧光标记会使酶活性有所下降,FITC标记后的降幅相对小于RhB标记的情况,但由于受空间位阻效应影响,在其他温度时两者耐热性均有所增强。同时荧光标记酶在70℃时才完全失去活性,与未荧光标记酶在60℃失活相比,提高了10℃。荧光光谱显示,随温度升高,荧光强度逐渐增大,而发射波长略有红移。在50℃、60℃、70℃下,FITC标记脂肪酶相应的f_U分别为0.63、0.91和1,而RhB标记脂肪酶则为0.65、0.71和1;在pH值的影响下,荧光标记脂肪酶活性会随着pH值偏离7.4而逐渐减小,同时其耐酸耐碱性有所提高。通过荧光光谱分析,荧光探针FITC易受pH值变化的影响,并不适合检测酶构象变化,而探针RhB在酸性和碱性条件下均较稳定,显示出其相对于探针FITC的优势。RhB标记脂肪酶在pH值3.2、4.7、7.4、8.7、11下相应的f_U分别为1、0.67、0、0.47和0.79;随着盐酸胍浓度从0 mol/L升至5 mol/L,荧光标记酶活性逐渐降低,荧光光谱的强度随着盐酸胍浓度的增大而降低,其中FITC标记酶在盐酸胍浓度从1 mol/L至5 mol/L下对应的f_U分别为0.38、0.68、0.84、0.95和1,而RhB标记酶相应的f_U分别为0.48、0.72、0.80、0.88和1;随着脲浓度从0 mol/L升至8 mol/L,荧光标记酶活性也逐渐降低,其活性变化趋势同盐酸胍的情况类似,荧光光谱的强度随着盐酸胍浓度的增大而逐渐降低,其中FITC标记酶在脲浓度从1 mol/L至8 mol/L下对应的f_U分别为0.21、0.30、0.58、0.79和1,而RhB标记酶相应的f_U分别为0.23、0.46、0.69、0.88和1。实验中将连接上FITC和RhB荧光探针的脂肪酶进行载体化,使用的聚合单体分别为聚乙二醇200二丙烯酸酯和聚乙二醇400二丙烯酸酯,采用月桂酸作为配体进行诱导。再通过紫外光引发聚合和石油醚索式抽提月桂酸后,获得了FITC标记LP(脂肪酶聚合物)-200、FITC标记LP-400、RhB标记LP-200和RhB标记LP-400四种聚合物。通过结合聚合物酶活曲线及其固体荧光光谱图,考察了该载体化过程中,聚合单体、配体诱导和配体抽提的情况对载体化的影响。结果表明:聚乙二醇400二丙烯酸酯由于其网格结构的合理性更适合该载体化过程;添加配体能够使酶构象发生部分改变使其更适合活性的表达;不对配体进行抽提会导致脂肪酶活性中心被配体占据从而大大降低活性。通过对四种荧光标记LP进行温度、pH值、溶解变性剂和沉淀变性剂作用下的变性,然后对可逆变性后的LP进行低浓度盐酸胍的复性研究,考察在各种条件下其酶活曲线和荧光光谱的变化。结果表明:在不同温度和pH作用下,四种LP仍能保持良好的活性,荧光光谱图能够反映酶构象变化所导致的活性改变;在溶解变性剂和沉淀变性剂作用下,随着时间的推移,四种LP活性先是下降,然后逐渐趋于稳定,其稳定后的活性均高于70%,显示出对变性剂不错的抗性,其荧光光谱反映的构象变化与活性的变化存在较好的联系;随着盐酸胍浓度的不断增大至5 mol/L,FITC标记LP-200的活性不断降低,荧光光谱的变化同酶活性变化相一致;选用低浓度盐酸胍对荧光标记LP-200进行复性,结果表明其酶活和荧光光谱的变化幅度较小。