论文部分内容阅读
拟穴青蟹（Scylla paramamosain）是我国重要的海水养殖蟹之一。近些年,随着养殖规模的不断扩大,养殖环境持续恶化,病害问题频发,给青蟹养殖业造成严重的损失。中草药具有增食促生长、抗菌、抗病毒、抗寄生虫、抗应激、提高免疫等功效,又因其纯天然、低毒副等特点,近些年被广泛的应用于各类水产经济动物养殖中。本文对番石榴叶抗青蟹病毒病机制进行了初步探讨,并针对青蟹养殖过程中分离的重要病原菌,研制复合抗菌中草药制剂,为青蟹病害防控、渔药生产提供技术支撑。主要结果如下:一、前期研究发现番石榴叶水提取物药浴能够增强染毒拟穴青蟹的部分免疫因子活性,提高成活率,但对其是否具有杀毒能力尚未可知。本研究利用番石榴叶水提物与病毒体外孵育后人工感染拟穴青蟹,探究其对MCRV、MCDV-1致病性的影响,确定其杀毒能力。结果发现,经过番石榴叶水提物孵育后的MCRV和MCDV-1仍具有活性,而且其致病性不受药物处理时间的影响,人工注射后,拟穴青蟹死亡率没有发生显著变化,表明番石榴叶水提物未能直接杀灭病毒。二、通过转录组学技术,研究了番石榴叶水提物药浴对拟穴青蟹免疫功能的影响。经高通量测序分析,共获得77.31 Gb有效数据,组装后得到204363个Unigenes,注释到六大数据库中的Unigenes共有80250个,占39.27%。显著差异基因分析发现,48 h药浴组有921个显著差异表达基因,其中上调基因498个,占54.07%,下调基因423个,占45.93%;72 h药浴组共筛选出1187个差异表达基因,包括557个上调基因,占比46.93%,630个下调基因,占53.07%。GO数据库比对发现,差异基因主要参与转录共激活、金属离子结合、蛋白质泛素化等;KEGG分析表明,差异基因主要集中在NOD样受体、NF-κB、Rap1、Jak-STAT、细胞凋亡等与免疫相关的信号通路中。筛选8个与甲壳动物免疫相关的主要基因进行差异表达基因定量验证,结果表明,药浴组中的CATD、STAT、POD3、Rab7、HSP90、SRB基因表达上调,CKR、Pt SPI基因下调。在48 h药浴组中,分别是对照组的1.55、3.75、2.03、2.07、2.08、2.43、﹣2.18、﹣3.02倍,在72 h药浴组中,分别是对照组的1.51、3.31、1.97、2.56、2.03、2.23、﹣2.18、﹣2.78倍。荧光定量验证与转录组分析结果类似,说明测序数据可信。因此可以认为,番石榴叶水提物可以通过调控拟穴青蟹体内参与免疫信号识别、转导及免疫效应的基因表达,提高拟穴青蟹的非特异性免疫功能和增强抗病毒能力。三、通过流行病学调查研究,从广州南沙青蟹主养殖区的病蟹体内分离到一株优势菌,通过细菌形态观察、生理生化鉴定及16S r DNA序列比对鉴定该菌,结果发现,分离株NS1SP18为副溶血弧菌（Vibrio parahemolyticus）。然后进行人工感染、组织病理学分析。发现该致病菌对拟穴青蟹有较强的致病性,注射感染48 h,半致死剂量(LD50)为3.18×104CFU/g。组织病理学分析发现该菌可造成机体严重损伤,导致患病拟穴青蟹肝细胞发生变性;心肌纤维肿大,细胞坏死;鳃小叶破损,网状鳃腔消失;肌纤维丝断裂,局部坏死。四、使用抑菌圈法和微量二倍稀释法测定110种中草药对5种拟穴青蟹常见致病菌（副溶血弧菌、溶藻弧菌、创伤弧菌、河流弧菌、嗜水气单胞菌）的体外抑制效果。结果发现,八角茴香、诃子、苏木、乌梅、五倍子的综合抗菌效果最好。将这5种中草药两两组合进行联合抗菌,结果显示药物间均为协同或相加作用。正交设计进行配伍组合,16种复方中筛选出一种综合效果最好的复合中草药制剂HC-6,平均抑菌圈为24.98 mm,平均MIC为2.73 mg/m L,平均MBC为19.53mg/m L,该复合制剂最优比例为八角茴香:诃子:苏木:乌梅:五倍子=2:2:1:4:3。综上所述,番石榴叶可通过调节拟穴青蟹免疫功能增强抗病毒能力,不具备杀灭病毒的作用;分离鉴定的副溶血弧菌有较强的致病性,可引起拟穴青蟹死亡;研制的复合制剂能够有效的抗副溶血弧菌等青蟹常见致病菌,可作为中药制剂或饲料添加剂进行更深入的研究。