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目的:通过基因工程手段获得高效表达的rhFGF20工程菌株;建立高密度培养技术及包涵体形式表达蛋白的变复性纯化技术,获得高纯度及具有生物学活性的rhFGF20蛋白。建立Aβ25-35诱导PC-12细胞的阿尔茨海默病细胞模型,观察rhFGF20对神经细胞的保护作用,并进一步利用RT-PCR和Western Blot技术分析相关基因和蛋白的表达情况,进而明确rhFGF20在阿尔茨海默疾病中对神经细胞的保护作用机制。 方法:1:将合成的fgf20全基因,与pET-3a载体连接,构建pET3a-hFGF20重组克隆载体。将克隆载体转化到BL21(DE3)pLysS感受态中,常规诱导表达4h后离心收集菌体,经超声破碎后得到以包涵体形式表达的rhFGF20重组蛋白。 2:用不同缓冲液洗涤包涵体后,采用两种不同的方法对其进行变复性和纯化:方法一是利用6 mol/L盐酸胍溶解包涵体rhFGF20蛋白后,采用传统的透析复性的方法,再利用蛋白与肝素特异性结合的特性进行肝素亲和层析纯化。方法二是利用8 mol/L脲溶解包涵体rhFGF20后,将其在变性情况下结合肝素柱,然后梯度降低变性剂浓度的方式进行柱上复性,并直接利用肝素亲和层析柱纯化复性后的蛋白。 3:得到高纯度重组蛋白后,利用MTT法分别检测rhFGF20蛋白对NIH3T3细胞和PC-12细胞的促增殖生物学活性。 4:为研究rhFGF20蛋白和阿尔茨海默疾病的关系,采取国际认可通用的构建阿尔茨海默病细胞模型的方法-利用Aβ25-35诱导PC-12细胞来构建阿尔茨海默病细胞模型,确定Aβ25-35诱导的浓度,检验不同浓度的rhFGF20蛋白对该模型细胞的保护作用。 5:进一步利用RT-PCR和Western Blot技术分析内质网应激相关基因和蛋白的表达情况。 结果:1:根据fgf20的编码序列进行全基因合成后克隆到pET-3a载体中,成功构建pET3a-rhFGF20重组质粒,将重组质粒转化到大肠杆菌菌株BL21(DE3)pLysS感受态中。在一定条件下,成功诱导表达以包涵体蛋白形式表达的hFGF20蛋白。 2:经过包涵体处理后。利用两种方式进行蛋白变复性及纯化,均得到了纯度较高的rhFGF20蛋白。 3:利用MTT法检测rhFGF20蛋白对NIH3T3和PC-12细胞的促增殖活性,结果表明,纯化后的rhFGF20蛋白对PC-12细胞的增殖活性较NIH3T3细胞更加显著,具有更好的灵敏度和特异性。 4:通过MTT法和LDH释放率检测证明了rhFGF20蛋白对阿尔茨海默病细胞模型有抗凋亡的保护作用,结果显示,rhFGF20有利于对抗阿尔茨海默病细胞模型的凋亡作用,并且验证了rhFGF20蛋白实验组的LDH释放率较Aβ25-35对照组明显减少,细胞损伤有所恢复,表明rhFGF20蛋白对Aβ25-35诱导PC-12细胞建立的阿尔茨海默病细胞有明显保护作用。 5:进一步利用RT-PCR和Western Blot技术分析内质网应激相关基因和蛋白的表达。结果显示,在rhFGF20蛋白作用实验组中GRP78和caspa se12蛋白的表达量下降,证实了rhFGF20对阿尔茨海默病的保护机制是通过内质网应激实现的。 结论:成功的利用大肠杆菌表达系统诱导表达rhFGF20蛋白,并通过柱上复性及纯化获得纯度较高的rhFGF20蛋白。纯化后的rhFGF20蛋白对PC-12细胞有显著的增殖活性,并通过Aβ25-35诱导PC-12细胞建立的阿尔茨海默病模型进一步验证其对神经保护的作用,而且这个保护机制是通过内质网应激实现的。