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糖尿病的发病率逐年升高,并呈现年轻化趋势。目前全球糖尿病患者已经达到2.2亿人,糖尿病已经成为影响人类健康和生活质量的重大疾病。糖尿病分为两种类型,它们一个共同的特点是胰岛β细胞的减少。目前临床用于β细胞替代治疗的方法主要有胰腺移植和胰岛移植,但这两种方法都存在供体紧缺和免疫排斥的缺点,仍不能大规模推广。近年来研究发现胰岛具有再生的潜能,通过促进自身胰岛再生来治疗糖尿病已经成为研究的一个热点。我们的前期研究发现骨髓移植能降低糖尿病小鼠血糖,促进糖尿病小鼠胰岛的再生。与骨髓细胞相比,骨髓间充质干细胞(Bone marrow mesenchymal stem cell, BMSC)具有扩增能力强、免疫原性低等优点,是细胞移植的理想来源。本研究首先对比了BMSC和骨髓单个核细胞(Bone marrow mononuclear cell, BMMC)对糖尿病小鼠胰岛功能的影响,观察胰岛再生的途径；然后观察BMSC在糖尿病小鼠体内的转归；最后阐明BMSC移植后改善糖尿病小鼠胰岛功能的旁分泌机制以及参与胰岛再生的信号转导通路。目的：阐明骨髓间充质干细胞移植对糖尿病小鼠胰岛功能的影响以及胰岛再生的途径。方法：通过链脲霉菌素(streptozotocin, STZ)腹腔内注射建立小鼠糖尿病模型。随机分成3组,分别为STZ组(尾静脉注射PBS)、BMMC组(尾静脉注射骨髓单个核细胞)、BMSC组(尾静脉注射骨髓间充质干细胞),移植后每周检测血糖变化,移植后1周和6周检测小鼠胰腺形态学、Insulin染色,并统计胰岛数目、胰岛β细胞数目,并通过检测胰腺组织中BrdU和胰腺干细胞的标记物(BrdU、PDX-1、Ngn3等)表达情况,了解胰岛再生的途径。结果：①血糖变化：STZ组小鼠血糖一直呈上升趋势；移植后第4周,BMMC组小鼠血糖出现显著下降(19.8±5.8mmol/L),并持续下降至第6周(18.7±5.2mmol/L),分别与STZ组(27.3±1.3mmol/L,27.5±1.1mmol/L)比较差异有统计学意义(p<0.01,p<0.01)；移植后第1周,BMSC组小鼠血糖就出现显著下降(20.0±7.6mmol/L),与STZ组(26.1±3.1mmol/L)和BMMC组(25.2±2.8mmol/L)相比有统计学意义(p<0.01,p<0.05),血糖持续下降至移植后第6周,此时血糖浓度为16.5±5.7mmol/L,与STZ组比较有统计学意义(p<0.01),但与BMMC组比较无统计学意义(p>0.05)。②胰岛数目变化：移植后1周,STZ组小鼠胰岛数目为11.3±4.1个；BMMC细胞组小鼠胰岛数目为12.8±5.0个,两组比较差异无统计学意义(p>0.05)；而BMSC组小鼠胰岛数目为21.6±7.6个,与STZ组和BMMC组小鼠比较差异有统计学意义(p<0.01,p<0.01)。移植后6周,STZ组小鼠胰岛数目仍较少(15.4±5.3个),BMMC组小鼠胰岛数增加(23.7±5.4个),与STZ组比较差异有统计学意义(p＜0.01),而BMSC组小鼠胰岛数目也显著增加(26.0±9.4个),与STZ组比较差异有统计学意义(p＜0.01)。③胰岛β细胞变化：移植后1周,STZ组小鼠胰岛β细胞数目较少(143.9±29.2个),BMMC组小鼠胰岛p细胞数也较少(155.3±98.9个),而BMSC组小鼠胰岛p细胞数较多(320.6±67.6个),与STZ组和BMMC组比较均有统计学意义(p＜O.01,p<0.01)。移植后6周,STZ组小鼠胰岛β细胞数进一步减少(82.1±33.0个),而BMMC组小鼠胰岛β细胞数增加(523.6±150.2个),与STZ组比较有统计学意义(p＜0.01), BMSC组胰岛β细胞数继续增多(553.6±242.2个),与STZ组比较有统计学意义(p＜0.01)。说明BMSC移植能改善糖尿病小鼠的胰岛功能,促进胰岛β细胞的再生。④胰腺组织相关标记物的表达：在BMMC组和BMSC组小鼠胰腺组织中发现胰岛β细胞的增殖,即发现同时表达Insulin和BrdU的细胞；还发现了胰岛干细胞,如同时表达PDX-1和BrdU,但不表达Insulin的细胞；发现Ngn3阳性的细胞；发现同时表达Insulin和Glucagon的细胞。而对照组未发现上述细胞。⑤TUNEL染色：在STZ组小鼠胰腺组织中发现较多阳性细胞,即胰岛凋亡细胞增加,而在BMMC组和BMSC组胰岛中阳性细胞较少,即凋亡细胞较少。结论：BMSC移植修复糖尿病小鼠胰岛功能的效果优于BMMC; BMSC移植促进糖尿病小鼠胰岛再生的途径既包括胰岛细胞自身增殖也包括胰岛干细胞的分化；BMSC移植抑制糖尿病小鼠胰岛细胞凋亡。目的：阐明骨髓间充质干细胞在糖尿病小鼠体内的分布及能否转分化为胰岛β细胞。方法：将绿色荧光蛋白(green fluorescent protein, GFP)转基因小鼠的骨髓间充质干细胞移植至糖尿病小鼠体内,检测小鼠胰腺中GFP阳性细胞的表达以及GFP与胰腺发育过程中相关标记物的表达情况。结果：移植后6周,在受体鼠胰腺组织中可见较多的GFP阳性的细胞,特别是在胰腺的胰岛及其周围,以及胰腺导管周围。在受体鼠胰腺组织内,除了极少数GFP阳性细胞表达Insulin(几千个GFP细胞中只有2个),绝大多数GFP阳性细胞并不表达Insulin,也未发现同时表达GFP和胰腺发育过程中相关标记物如Nestin、Ngn3、PDX-1、NeuroD、Nkx2.2、NKX6.1、Pax4、Pax6的细胞。结论：外源性BMSC能迁移至损伤的胰腺组织内,特别是胰岛和胰腺导管周围；BMSC移植后血糖的降低并不是由BMSC分化为胰岛β细胞所致。目的：阐明骨髓间充质干细胞移植修复糖尿病小鼠胰岛功能的旁分泌机制及参与胰岛再生的信号通路。方法：旁分泌机制实验：①体内实验：将糖尿病小鼠分为三组：STZ组(尾静脉注射空培养基)、BMSC组(尾静脉注射BMSC)、BMSC-CM组(尾静脉注射BMSC-CM),分别观察血糖变化及胰岛数、胰岛p细胞数变化。②体外实验：将STZ损伤的小鼠胰岛分为2组：STZ组、BMSC-CM组(加入BMSC-CM共培养),了解胰岛细胞形态及BrdU表达情况。信号通路机制实验：①体内实验：将糖尿病小鼠分成两组：STZ组、BMSC组,检测胰岛组织中pAkt、pErk的表达变化。②体外实验：首先,将STZ损伤的小鼠胰岛分成2组STZ组、BMSC-CM组,了解胰岛细胞pAkt、pErk的表达变化。其次,用LY294002、PD98059分别将Akt、Erk信号通路阻断后,再观察胰岛细胞形态及BrdU表达情况。再次,将Akt信号通路阻断后,观察pAkt的表达。结果：旁分泌机制实验：①血糖变化：STZ组小鼠血糖一直呈上升趋势。移植后第1周,BMSC组血糖出现显著下降(20.0±7.6mmol/L),并一直持续下降至移植后第6周(16.5±5.7mmol/L),与STZ组(26.1±3.1mmol/L,27.5±1.1mmol/L)比较差异有统计学意义(p<0.05,p<0.01)。移植后第1周,BMSC-CM组血糖也出现明显下降(17.5±4.1mmol/L),与STZ组比较差异有统计学意义(p<0.05),与BMSC组比较差异无统计学意义(p>0.05),并一直持续至第6周(11.6±4.9mmol/L),与STZ组比较差异有显著统计学意义(p<0.01)。②胰岛细胞和β细胞数变化：移植后6周,STZ组小鼠胰岛数目仍较少(15.4±5.3个),胰岛β细胞数也较少(82.1±33.0个)；BMSC组小鼠胰岛数目增加(26.0±9.4个),胰岛β细胞数目也增加(553.6±242.2个),与STZ组比较差异有显著统计学意义(p<0.01, p<0.01); BMSC-CM组小鼠胰岛数目较多(32.3±6.2个),胰岛β细胞数目也较多(621.0±106.1个),与STZ组比较差异有统计学意义(p<0.01,p<0.01),与BMMC组相比无统计学差异(p>0.05)。③体外实验发现BMSC-CM和胰岛细胞共培养后,胰岛BrdU阳性细胞数明显增多。信号通路机制实验：体内、外实验表明BMSC组小鼠胰岛细胞pAkt、pErk的表达上调。PI3K阻滞剂LY294002和MEK1阻滞剂PD98059分别阻断两条信号通路后,在STZ组、BMSC组、PD98059组胰岛中发现BrdU阳性的细胞,而在LY294002组和LY294002+PD98059组胰岛中未发现BrdU阳性的细胞,而且其胰岛细胞团体积较小,这就表明只有阻断Akt通路才能遏制胰岛细胞增殖。Insulin和BrdU免疫荧光双染色,结果发现BMSC-CM组和PD98059组胰岛中同时表达Insulin和BrdU的细胞较多,即增殖的胰岛β细胞较多。Western Blotting检测发现,加入BMSC-CM后pAkt的表达显著上调,但加入LY294002后,即使加入BMSC-CM也不能上调pAkt。RT-PCR检测发现,胰岛细胞和BMSC-CM共培养后,Notch1基因显著下调。结论：BMSC移植通过旁分泌作用修复糖尿病小鼠的胰岛；BMSC移植通过Akt通路促进糖尿病小鼠胰岛的增殖；BMSC移植可能通过Notch通路促进糖尿病小鼠胰岛干细胞的分化。结论1. BMSC移植能促进糖尿病小鼠胰岛的增殖和胰岛干细胞的分化,效果优于BMMC移植。2. BMSC移植通过旁分泌机制修复糖尿病小鼠的胰岛。3. BMSC移植通过Akt通路促进糖尿病小鼠胰岛细胞的增殖。4. BMSC移植可能通过Notch通路促进糖尿病小鼠胰岛干细胞的分化。