背景与目的风湿性主动脉瓣狭窄是常见的导致左心室超负荷的疾病,是造成心力衰竭的主要病因之一;但是,通过人工瓣膜置换解除心室负荷并不能使所有患者同等受益。患者术后心脏形态、功能的恢复情况与术前心功能情况呈正相关。我们在前期动物实验中也发现,升主动脉缩窄50%的左室超负荷大鼠心脏功能会经历一段相对正常甚至轻度增加的代偿期以及进行性降低的失代偿期,并在进一步的去负荷手术中发现代偿阶段的左室超负荷大鼠心脏形态恢复佳,而失代偿阶段却不能有效的恢复初始水平。虽然我们的前期研究很好的验证了临床现象,但对于左室超负荷致心功能代偿向失代偿的转变的具体机制尚未明确,有待进一步研究。在超负荷所致机械应力作用下产生包括:心肌细胞肥大、间质纤维化、微血管结构破坏、间质胶原沉积等变化统称为心肌重塑,是心肌结构改变的主要病理学特征。在心肌组织中,约70%的细胞都是非心肌细胞,成纤维细胞及内皮细胞是其中数量最多的细胞种类。我们推测心肌细胞除了自身的适应性肥大之外,可能对间质重塑的发生发展也起到重要的调控作用,而间质重塑导致的基质结构的改变可能是心脏功能从代偿到失代偿转变的标志。因此,研究超负荷过程中不同时期心肌重塑的变化特点及分子机制具有重要的意义。大量研究表明,Krüppel样因子家族成员KLF15对间质纤维化有重要的抑制作用,但具体机制不清楚。有研究表明,慢性主动脉瓣狭窄患者心肌组织TGF-β显著增加,同时,受TGF-β调控的CTGF的表达也增强并证实了Smad3的磷酸化是TGF-β调控CTGF表达的关键环节,推测可能与KLF15竞争性抑制磷酸化Smad3对CTGF转录启动子的促进作用。另一方面,有研究发现:慢性压力超负荷会导致p38-MAPK活化进而抑制KLF15的表达。推测KLF15低表达可能是心肌细胞对间质纤维化调控的关键因素。最新研究显示:KLF15对心肌间质血管生成中有着重要的作用,可能是KLF15抑制心功能失代偿性转变的另一关键途径,其机制可能与KLF15正性调控VEGF的分泌有关,有待进一步研究。基于前期研究及国内外进展,我们推测在超负荷疾病的病理生理发展过程中不同时期心肌重塑的变化各有特点,而间质性重塑是导致心功能衰竭的重要环节。KLF15作为关键性负性调控因子抑制间质重塑从而抑制心功能衰竭。本研究引入KLF15过表达转基因小鼠,并通过构建左室压力超负荷小鼠模型,对KLF15抑制左心室压力超负荷所致心功能衰竭作用及机制进行深入研究,有助于我们深入理解瓣膜疾病等压力超负荷疾病的病理生理过程,并为改善慢性重症瓣膜疾病的临床转归提供理论依据。研究方法1.选用8-10周龄野生型(WT)健康雄性SPF级饲养C57/BL6J小鼠,在非人工通气条件下行升主动脉缩窄术构建左室压力超负荷小鼠模型。分别于术前及术后1周、2周、3周、4周、5周、6周行心脏超声检查其射血分数(EF)及短轴缩短率(FS),明确在不同时间点左室超负荷小鼠的心功能情况。在确定小鼠心功能代偿期及失代偿期的具体时间点后,进一步采用M型心脏超声及电子天平对其左室厚度、左室内径、心脏重量、肺重量等具体指标进行检测,从大体形态上评价左室超负荷小鼠在不同阶段心脏的形态学变化特点。2.在左室超负荷野生型小鼠心功能代偿期及失代偿期分别对其心肌组织行HE、Masson染色及血管内皮特异性标志物CD31免疫组化染色;ELⅠSA检测其心肌组织Ⅰ型胶原及Ⅲ型胶原含量;WB检测心肌组织KLF15及其相关蛋白CTGF、VEGF的表达情况,p38、Smad3的磷酸化水平;并设置假手术组为空白对照。从心肌显微结构及分子表达层面进一步阐明心功能代偿期及失代偿期的不同特点,并对KLF15与其相关蛋白CTGF、VEGF表达水平及p38、Smad3磷酸化水平的内在关系进行更深入的研究。3.引入心脏过表达KLF15转基因(TG)小鼠为研究对象建立左室压力超负荷模型,以野生型小鼠左室压力超负荷模型为阴性对照,并分别设置假手术组作为空白对照。通过应用超声心动图、心脏重量、肺重量、病理学及免疫组化染色、ELISA及WB等检测方法从大体标本、微观结构及分子生物学三个层面对KLF15如何调控相关因子的表达从而抑制左室超负荷所致心功能衰竭的具体机制进行更深一步的探讨研究结果1.超声心动图提示,在升主动脉缩窄术后2周时,与假手术组相比,超负荷组EF及FS均有一定程度的增加,且达到代偿高峰,但差异无统计学意义。2周之后超负荷组心功能随缩窄时间延长呈下降趋势,且在缩窄5周及6周与假手术组出现明显差异(P<0.05)。从心脏形态变化来看,心功能代偿期小鼠心脏主要呈现出以IVS、LVPW增加为特征的向心性肥厚表现,而心功能失代偿期小鼠主要呈现以LVID增加为特征的离心性肥厚表现。心脏重量及肺重量的检测结果表明,心功能代偿期主要表现为心脏重量的增加,而在心功能失代偿期心脏重量与肺重量均有增加且肺重量增加更为显著。2.HE染色显示:心功能代偿期小鼠心肌细胞出现肌纤维横截面增粗、间距增加,细胞核深染等肥大表现,心功能失代偿期小鼠在肌纤维增粗的同时,其间距进一步增加,且出现胞质断裂,碎片样改变及肌纤维排列不规则等表现。Masson染色显示:心功能失代偿期小鼠心肌组织出现了严重的纤维化反应。CD31免疫组化染色显示心功能代偿期小鼠心肌组织CD31密度增加,而心功能失代偿期小鼠CD31密度明显降低。ELISA显示:心功能代偿期小鼠心肌Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白含量与假手术组相比差异无统计学意义(P﹥0.05);心功能失代偿期小鼠心肌Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白含量与假手术组相比明显增加(P<0.01)。WB显示:心功能代偿期小鼠心肌仅表现出Smad3磷酸化水平的增加(P<0.01),而心功能失代偿期小鼠心肌KLF15及VEGF表达水平降低(P<0.01)、CTGF表达水平及p38、Smad3磷酸化水平均明显增加(P<0.01)。3.在左室超负荷6周的条件下,超声心动图提示,与WT小鼠相比,TG小鼠LVID的增加及EF、FS的降低均有明显减轻。肺重量增加相对轻微。病理学染色显示野生型小鼠表现出更为严重的间质纤维化反应。CD31免疫组化染色显示WT及TG小鼠心肌组织CD31密度均明显降低,TG小鼠心肌组织CD31密度降低程度更为轻微。ELISA显示:左室超负荷WT小鼠心肌Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白含量与左室超负荷TG小鼠相比明显增加(P<0.01)。WB显示:与左室超负荷WT小鼠相比,左室超负荷组TG小鼠CTGF表达水平明显降低(P<0.01);VEGF及KLF15表达水平均明显增加(P<0.01)。结论1.本研究采用的非人工通气升主动脉缩窄术可成功构建左室超负荷动物模型,且在应用该建模方法后2周和6周两个不同时相点,分别可成功构建出心功能代偿模型及心功能失代偿模型;2.在心功能代偿期,心肌重塑的特点主要表现为心肌细胞肥大及间质微血管密度一定程度的代偿增加,无明显间质纤维化,心功能可维持正常甚至一定程度代偿增加;其机制与KLF15抑制p-Smad3对CTGF转录的促进作用及对VEGF的正性调控有关。3.在心功能失代偿期,除了心肌细胞本身的肥大之外,还出现了心肌间质严重的纤维化、胶原蛋白沉积及间质血管生成障碍等复杂的立体的重塑,并伴随着心功能的降低。其机制与p38磷酸化抑制KLF15表达,低表达的KLF15失去了对CTGF转录的抑制作用及VEGF转录的促进作用有关。4.心脏特异性KLF15过表达转基因小鼠可明显改善左室压力超负荷6周所导致的心功能衰竭,其作用途径与抑制间质纤维化、胶原沉积及促进血管生成作用有关。具体机制与KLF15过表达补偿了上游磷酸化p38对其的抑制作用,并通过正性调控VEGF表达与负性调控CTGF表达实现。