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自然界中大多数细菌并不是以单细胞的形式生活,而是以多细胞聚集的形式生活在由多种基质包裹的生物被膜中,抵御温度、渗透压、pH、紫外线、金属离子等不利因素的影响。生物被膜是由微菌落包围着由细胞外聚合物(Extracellular Polymeric Substances,EPS)组成的复合体。EPS占生物被膜生物量的90%,是保护生物膜内细胞的重要物理屏障。它包括将细菌细胞包裹在密集的EPS基质成分中,并牢牢地附着在生物和非生物表面。因此,生物被膜是细菌在自然环境中生存的重要组成部分,是一种广泛存在的自我保护性的生存策略。细菌生物被膜的形成是一个动态发展的过程,包括最初的表面附着、微菌落形成、成熟、扩散和传播等一系列发展阶段,最后形成一个复杂的、有组织的多细胞系统。生物被膜的发展过程受群体感应系统和环二鸟苷酸环化酶(cyclic di-GMP,c-di-GMP)的调控。c-di-GMP是细菌中普遍存在的第二信使分子,在细菌对自然环境的适应中起重要作用。c-di-GMP由两分子的GTP通过一类含有GG(D/E)EF结构域的环二鸟苷酸环化酶(diguanylate cyclase,DGC)催化合成,合成后的c-di-GMP被含有EAL或HD-GYP结构域的磷酸二酯酶(phosphodiesterase,PDE)蛋白水解为5’-phosphphoguanylyl-(3’-5’)-鸟苷(pGpG),随后被进一步分解为单磷酸鸟苷(GMP)。在细菌细胞内,c-di-GMP含量增加会促进生物被膜的形成,降低细胞的运动水平;c-di-GMP含量的降低则会抑制生物被膜的形成,提高细胞的运动水平,所以,c-di-GMP很大程度上起到了将细菌由游离状态调控到生物膜状态的作用。红球菌Rhodococcus sp.NJ-530是从南极浮冰中分离出的一株放线菌,是研究海洋细菌对极端环境适应机制的代表性细菌。尽管人们对具有生物被膜形成能力的细菌研究十分广泛,但目前关于放线菌的调查研究仍非常局限。通过对Rhodococcus sp.NJ-530进行全基因组测序后发现该菌中含有许多催化c-di-GMP合成与降解的基因,推测红球菌Rhodococcus sp.NJ-530适应南极极端环境与其特殊的生命活动——生物被膜的形成有关。本论文以分离自南极海冰的红球菌Rhodococcus sp.NJ-530为目标菌株,主要进行了以下研究内容:(1)在红球菌Rhodococcus sp.NJ-530全基因组中查找并比对环二鸟苷酸环化酶基因dgc,通过PCR技术设计引物体外合成了该基因,并对其进行了生物信息学分析,发现该基因全长为948 bp,编码315个氨基酸,预测蛋白分子量为34.6 KDa,等电点为5.58,GenBank登录号为MN419917。(2)利用实时荧光定量qRT-PCR技术与微量板检测技术,探究了红球菌Rhodococcus sp.NJ-530在温度和盐度胁迫条件下培养时,细胞内环二鸟苷酸环化酶基因dgc的转录水平与其生物被膜形成量的变化趋势.qRT-PCR结果表明dgc基因在低温(-5℃、0℃和5℃)低盐(16‰)和正常盐度(32‰)条件下表达量较高,随着温度和盐度的升高,基因的表达逐渐被抑制。同时,微量板检测实验表明,dgc基因正向调控c-di-GMP含量与生物被膜的形成量。当红球菌于最高温度(25℃)培养时,生物被膜的形成量最少。随着温度的逐渐降低,生物被膜的累积量不断增加。同样地,低盐(16‰)和正常盐度(32‰)下被膜的形成量较多,盐度升高,其形成量明显受到抑制。(3)将体外合成的环二鸟苷酸环化酶基因dgc连接至表达载体,并将其转入大肠杆菌工程菌BL21(DE3)中进行原核表达与纯化,并获得了环二鸟苷酸环化酶DGC蛋白,Western Blot分析结果显示目的蛋白存在于细胞破碎上清液中,且分子量与预测分子量相同。(4)对大肠杆菌工程菌BL21(DE3)进行体内活性研究,探究重组蛋白对大肠杆菌生物被膜的形成是否具有调节作用。体内活性实验表明含有DGC重组蛋白的工程菌与野生型大肠杆菌相比产生了更多的生物被膜,证明DGC重组蛋白在大肠杆菌体内催化合成了更多的c-di-GMP,生物被膜含量也相应增加。综上所述,本论文的研究内容及成果显示生物被膜的形成对红球菌Rhodococcus sp.NJ-530适应南极的极端环境起到了重要的保护作用,有助于了解放线菌等海洋细菌在南极极端环境中的适应机制。同时,通过对环二鸟苷酸环化酶基因的生物信息学分析和生物被膜形成过程的动态监测,掌握了细菌生物被膜的动态发展过程,为有效清除低温腐败菌对食物的腐败作用,以及病原菌对医疗器械和人体的感染侵害作用提供了重要思路。