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蛋白磷酸酶行使的去磷酸化作用在调控细胞内各种生命过程中起了重要的作用。PP2A是主要的丝/苏氨酸蛋白磷酸酶之一。本实验室之前已经研究了PP2A催化亚基在金鱼和小白鼠眼睛中表达模式,在本论文中,我们把重点放在了研究PP2A的调节亚基B’家族δ(Delta)基因,首先,我们运用RACE技术克隆出了金鱼中的δ基因的cDNA全长,然后,利用RT—PCR和Western blot分别分析并研究了该基因在金鱼不同组织和不同胚胎时期的mRNA水平和蛋白水平的表达,其结果如下:
(1)金鱼中PP2A B—δ的cDNA全长2415bp,其中包含1668bp的开放阅读框,编码一个含555个氨基酸的蛋白质,预测的分子量约为64.4kDa。该蛋白质序列与人的同源序列的相似度为81.8%,与家鼠的为85.2%,与非洲爪蟾的为78.7%,氨基酸序列同源性比较表明了δ调节亚基的氨基酸序列在不同物种间都具有比较高的同源性,暗示了该基因在进化和功能上的保守性,同时也说明其在功能上的重要性,而在氨基和羧基末端的差异则暗示了B亚基具有的多种功能,如决定底物的特异性和细胞定位。
(2) RT—PCR分析证明该基因mRNA表达水平在大脑中为最高,肝脏、精巢、卵巢、肾脏和鳃中次之,鳍中最少。在不同胚胎时期中,两细胞期、多细胞期、囊胚期和原肠胚期表达最高,其他时期相对较低。在蛋白水平上,精巢、卵巢、大脑和心脏中最高,肝脏中次之,肾脏、鳃和鳍中最少。在胚胎中,两细胞期、多细胞期、囊胚期、原肠胚期和神经胚期及视原基期表达最高,脑泡分化和眼色素期表达量最少。由此可以推测PP2AB—δ基因在金鱼不同组织和胚胎发育的不同时期中可能起着多种重要作用。
(3)另外,我们还成功构建了PP2A B—δ基因的反义表达载体。利用这个载体,我们可以进一步研究该基因对金鱼的发育调控。
总之,这些结果为我们以后探索PP2A B—δ基因在较低等的脊椎动物中具体的功能奠定了基础。